 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 2690 | 回復(fù): 12 | ||
yujijiang銅蟲 (初入文壇)
|
[求助]
DGGE上樣孔很亮，DNA跑不下來
|
|
最近在做氨氧化細(xì)菌的生物多樣性，我擴(kuò)增了amoA的基因特異性很好，條帶單一，但是做DGGE時(shí)好多跑不出孔，已經(jīng)嘗試了很多次，情況依舊。請(qǐng)各位大蝦給小弟指點(diǎn)迷津。。。萬分感謝！ DGGE的條件：6%的膠，變性梯度是30-60%，沒有堆積膠，上樣前PCR產(chǎn)物為純化，上樣前會(huì)將孔沖洗一下，電泳時(shí)間90V，13h。 我灌膠是做的0%和100%的母液，灌膠時(shí)高低濃度為14毫升，加入100微升APS和9微升的TEMED。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
311求調(diào)劑
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
302求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
被我言中：新模板不強(qiáng)調(diào)格式了，假專家開始管格式了
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
303求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
考研求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
085601專碩，總分342求調(diào)劑，地區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
085601材料工程專碩求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
一志愿天津大學(xué)化學(xué)工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
能源材料化學(xué)課題組招收碩士研究生8-10名
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
296求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
lstt09nk(金幣+3): 感謝交流，歡迎常來 2011-05-05 18:22:07
lstt09nk(金幣+3): 感謝交流，歡迎常來 2011-05-05 18:22:07
|
我做過Archaea 的amoA基因的DGGE，效果很好。 細(xì)菌的amoA基因的DGGE沒做過。呵呵。 Archaeal amoA genes were amplified using primers CrenamoA-23f and CrenamoA-616r without the requirement of a GC clamp. Archaeal amoA gene DGGE protocol: 0.75-mm-thick 8% (w/v) polyacrylamide gels, 15% to 60%,Gels were electrophoresed in 1 × TAE buffer at 60 °C for 14 h at 90 V. 樓主可以將你的引物序列，名稱，PCR程序貼出來看看 |
2樓2011-05-05 12:26:30
3樓2011-05-05 13:00:00
yujijiang
銅蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 58.7
- 帖子: 32
- 在線: 15.1小時(shí)
- 蟲號(hào): 1188048
- 注冊(cè): 2011-01-12
- 專業(yè): 微生物生態(tài)學(xué)
4樓2011-05-05 13:34:01
yujijiang
銅蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 58.7
- 帖子: 32
- 在線: 15.1小時(shí)
- 蟲號(hào): 1188048
- 注冊(cè): 2011-01-12
- 專業(yè): 微生物生態(tài)學(xué)
5樓2011-05-05 13:35:14
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金幣+5): 熱心 2011-05-05 18:22:27
lstt09nk(金幣+5): 熱心 2011-05-05 18:22:27
|
文獻(xiàn)中對(duì)細(xì)菌的amoA基因的DGGE操作條件，30-70%變化梯度用的比較多，也有40-60%的梯度。所以你實(shí)驗(yàn)中的操作條件應(yīng)當(dāng)合適的。 對(duì)了，你的引物是amoA-1F和amoA-2R吧？文獻(xiàn)報(bào)道較多的那對(duì)？加上GC夾子擴(kuò)增很難得呀，你這么容易就擴(kuò)增出來了。。。。 如果我做的DGGE圖如你所貼，我會(huì)把膠重新做一遍，尤其是0%和100%的膠重新配。還有，你的PCR產(chǎn)物如果效果很好的話，大可不必進(jìn)行純化也可進(jìn)行DGGE，因?yàn)橛械腜CR產(chǎn)物純化試劑盒純化效果很差，會(huì)把PCR片段搞斷裂，彌散，也許你純化后可以走一次瓊脂糖膠看看純化后的效果。 |
6樓2011-05-05 14:32:39
yujijiang
銅蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 58.7
- 帖子: 32
- 在線: 15.1小時(shí)
- 蟲號(hào): 1188048
- 注冊(cè): 2011-01-12
- 專業(yè): 微生物生態(tài)學(xué)
|
我用的引物是amoA-1F-GC和amoA-2R。。。。用的是類似巢式PCR進(jìn)行兩輪擴(kuò)增的。 另外，我配0%和100%的母液時(shí)都會(huì)過一下milipore的0.22um濾膜,因?yàn)槟敢涸诒渲蟹胖靡欢螘r(shí)間后出現(xiàn)絮狀的沉淀。。。。是否過膜也會(huì)有影響呢？ 其次，上樣前每次都要沖洗一下孔，有蟲友說孔里是有高鹽離子，丙烯酰胺凝聚時(shí)產(chǎn)生的，不沖洗的話也會(huì)有影響。 我的PCR是沒有經(jīng)過純化，純化時(shí)由于試劑盒的回收率不同，會(huì)有一定程度的損失。 |
7樓2011-05-06 00:19:53
8樓2011-05-06 09:43:04
ureyguo
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1742.9
- 散金: 888
- 紅花: 12
- 帖子: 407
- 在線: 117.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 477268
- 注冊(cè): 2007-12-13
- 專業(yè): 海洋環(huán)境科學(xué)
9樓2011-05-06 17:31:10
10樓2012-09-25 16:09:27
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 yujijiang 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)化學(xué)工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑 +6 | yangfz 2026-03-17 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 ，六級(jí)已過，有科研經(jīng)歷 +8 | 曦熙兮 2026-03-15 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 301求調(diào)劑 +4 | A_JiXing 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 302求調(diào)劑 +9 | 負(fù)心者當(dāng)誅 2026-03-11 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +3 | p asserby. 2026-03-15 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 26考研求調(diào)劑 +6 | 丶宏Sir 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 梁成偉老師課題組歡迎你的加入 +8 | 一鴨鴨喲 2026-03-14 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 材料專碩274一志愿陜西師范大學(xué)求調(diào)劑 +5 | 薛云鵬 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑 +7 | 邱gl 2026-03-11 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +3 | 聽風(fēng)就是雨； 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 285求調(diào)劑 +6 | ytter 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 277材料科學(xué)與工程080500求調(diào)劑 +3 | 自由煎餅果子 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 東華理工大學(xué)化材專業(yè)26屆碩士博士申請(qǐng) +6 | zlingli 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 26考研一志愿中國(guó)石油大學(xué)(華東)305分求調(diào)劑 +3 | 嘉年新程 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +3 | 呼呼？~+123456 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 招收0805（材料）調(diào)劑 +3 | 18595523086 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 7712b 2026-03-13 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 315求調(diào)劑 +9 | 小羊小羊_ 2026-03-11 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +7 | 18880831720 2026-03-11 | 7/350 |
|
|
|
[考博] 26讀博 +4 | Rui135246 2026-03-12 | 10/500 |
|