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yujijiang銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
DGGE上樣孔很亮，DNA跑不下來(lái)
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最近在做氨氧化細(xì)菌的生物多樣性，我擴(kuò)增了amoA的基因特異性很好，條帶單一，但是做DGGE時(shí)好多跑不出孔，已經(jīng)嘗試了很多次，情況依舊。請(qǐng)各位大蝦給小弟指點(diǎn)迷津。。。萬(wàn)分感謝！ DGGE的條件：6%的膠，變性梯度是30-60%，沒(méi)有堆積膠，上樣前PCR產(chǎn)物為純化，上樣前會(huì)將孔沖洗一下，電泳時(shí)間90V，13h。 我灌膠是做的0%和100%的母液，灌膠時(shí)高低濃度為14毫升，加入100微升APS和9微升的TEMED。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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lstt09nk(金幣+3): 感謝交流，歡迎常來(lái) 2011-05-05 18:22:07
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我做過(guò)Archaea 的amoA基因的DGGE，效果很好。 細(xì)菌的amoA基因的DGGE沒(méi)做過(guò)。呵呵。 Archaeal amoA genes were amplified using primers CrenamoA-23f and CrenamoA-616r without the requirement of a GC clamp. Archaeal amoA gene DGGE protocol: 0.75-mm-thick 8% (w/v) polyacrylamide gels, 15% to 60%,Gels were electrophoresed in 1 × TAE buffer at 60 °C for 14 h at 90 V. 樓主可以將你的引物序列，名稱，PCR程序貼出來(lái)看看 |
2樓2011-05-05 12:26:30
冬蟲(chóng)夏草1
金蟲(chóng) (小有名氣)
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3樓2011-05-05 13:00:00
yujijiang
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4樓2011-05-05 13:34:01
yujijiang
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5樓2011-05-05 13:35:14
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金幣+5): 熱心 2011-05-05 18:22:27
lstt09nk(金幣+5): 熱心 2011-05-05 18:22:27
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文獻(xiàn)中對(duì)細(xì)菌的amoA基因的DGGE操作條件，30-70%變化梯度用的比較多，也有40-60%的梯度。所以你實(shí)驗(yàn)中的操作條件應(yīng)當(dāng)合適的。 對(duì)了，你的引物是amoA-1F和amoA-2R吧？文獻(xiàn)報(bào)道較多的那對(duì)？加上GC夾子擴(kuò)增很難得呀，你這么容易就擴(kuò)增出來(lái)了。。。。 如果我做的DGGE圖如你所貼，我會(huì)把膠重新做一遍，尤其是0%和100%的膠重新配。還有，你的PCR產(chǎn)物如果效果很好的話，大可不必進(jìn)行純化也可進(jìn)行DGGE，因?yàn)橛械腜CR產(chǎn)物純化試劑盒純化效果很差，會(huì)把PCR片段搞斷裂，彌散，也許你純化后可以走一次瓊脂糖膠看看純化后的效果。 |
6樓2011-05-05 14:32:39
yujijiang
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我用的引物是amoA-1F-GC和amoA-2R。。。。用的是類似巢式PCR進(jìn)行兩輪擴(kuò)增的。 另外，我配0%和100%的母液時(shí)都會(huì)過(guò)一下milipore的0.22um濾膜,因?yàn)槟敢涸诒渲蟹胖靡欢螘r(shí)間后出現(xiàn)絮狀的沉淀。。。。是否過(guò)膜也會(huì)有影響呢？ 其次，上樣前每次都要沖洗一下孔，有蟲(chóng)友說(shuō)孔里是有高鹽離子，丙烯酰胺凝聚時(shí)產(chǎn)生的，不沖洗的話也會(huì)有影響。 我的PCR是沒(méi)有經(jīng)過(guò)純化，純化時(shí)由于試劑盒的回收率不同，會(huì)有一定程度的損失。 |
7樓2011-05-06 00:19:53
8樓2011-05-06 09:43:04
ureyguo
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9樓2011-05-06 17:31:10
10樓2012-09-25 16:09:27
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