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爛鐵

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[交流] 關(guān)于Western blot的抗體孵育階段

Western blot
麗春紅染色已經(jīng)確定轉(zhuǎn)膜成功了，但是孵育后顯色沒有條帶。
我介紹一下我的實(shí)驗(yàn)過程：
一抗：Anti-His-HRP
二抗：HRP-Rabbit-Anti-Mouse lgG
一抗，二抗都是用封閉液按1:5000稀釋
使用的溶液如下（按照抗體說明書配制的）：
PBS

137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4
PBST

PBS +0.05% Tween-20,v/v)
Blocking buffer

PBST + 5% nonfat, dry milk, w/v)

孵育時(shí)，我把膜放到一個(gè)塑料樣品袋中，然后加入抗體稀釋劑，一抗過夜孵育，二抗孵育一小時(shí)，這樣在樣品袋中孵育是不是不利于抗體與膜上蛋白的結(jié)合，對(duì)孵育效果產(chǎn)生影響？怎樣結(jié)合效果才好呢？
顯色步用的是 3%的4-氯-1-萘酚+30%雙氧水+50mM的Tris-Hcl 室溫下浸泡震蕩大約30分鐘（也是根據(jù)抗體說明書上面的方法）。

希望大家?guī)椭。?br />
[ Last edited by 爛鐵 on 2011-5-25 at 14:22 ]

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1樓 2011-05-25 14:21:28

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wuzuobin125

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爛鐵(金幣+1): 2011-05-26 14:11:19

對(duì)這個(gè)不懂，只能幫你頂上去，讓行家看到了。

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2樓2011-05-25 16:29:10

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forrestgump

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西瓜(金幣+2): 歡迎交流。濃度梯度如何設(shè)置呢？ 2011-05-26 12:33:47
爛鐵(金幣+2): 2011-05-26 14:11:04

一抗你得摸索一個(gè)濃度梯度，上來就1：5000是否很了點(diǎn)

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3樓2011-05-26 03:12:05

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雪山飛狐7233

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西瓜(金幣+5, EPI+1): 很有經(jīng)驗(yàn)，明顯是專家！P.S. 三塔是指Santa Cruz吧？ 2011-05-26 12:33:21
爛鐵(金幣+10): 2011-05-26 14:10:40

引用回帖:

Originally posted by 爛鐵 at 2011-05-25 14:21:28:
Western blot
麗春紅染色已經(jīng)確定轉(zhuǎn)膜成功了，但是孵育后顯色沒有條帶。
我介紹一下我的實(shí)驗(yàn)過程：
一抗：Anti-His-HRP
二抗：HRP-Rabbit-Anti-Mouse lgG
一抗，二抗都是用封閉液按1:5000稀釋
使用的溶液如 ...

1. 我不知道你的抗體是什么牌子的，如果是三塔之類的抗體1:5000顯然是抗體的濃度太低，可以加大濃度，三塔的抗體一般我都用到1:1000/500，即使是AbCOM，cell signaling你的濃度也低，說明書只能說在最佳條件下才能有效（這種條件一般都不具備）。還有是不是能有個(gè)陽性結(jié)果作為對(duì)照（比如別人做出過來），當(dāng)然抗體的批號(hào)要一致的。
2. 一抗封閉過夜最好在4度層析室或者層析柜里進(jìn)行，如果在室溫會(huì)嚴(yán)重影響抗體的效價(jià)。
3. 二抗封閉時(shí)間應(yīng)該超過二小時(shí)，可以在室溫進(jìn)行。
4. 一抗，二抗封閉之前應(yīng)該用TBST(你的應(yīng)該是PBST)洗3次，10min/次。
5. 顯色我們用自配的
PCA
Lum
1M Tris-Hcl(pH8.5)
H2O2
H2O
個(gè)人感覺非常好用。

[ Last edited by 雪山飛狐7233 on 2011-5-26 at 06:00 ]

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4樓2011-05-26 05:57:14

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appleXYJ

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西瓜(金幣+3): 歡迎交流經(jīng)驗(yàn) 2011-05-26 12:34:06
爛鐵(金幣+5): 2011-05-26 14:10:48

我們都是封閉過夜的，第二天做抗體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)！基本上都是一小時(shí)！
還有向樓上所說，抗體的濃度你參考說明書，至少要預(yù)實(shí)驗(yàn)看看那個(gè)濃度合適！
實(shí)驗(yàn)不是一次就做好的，要摸索幾次的，一次做好就太簡(jiǎn)單了！祝你好運(yùn)，加油！

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5樓2011-05-26 09:15:23

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爛鐵

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引用回帖:

Originally posted by 雪山飛狐7233 at 2011-05-26 05:57:14:
1. 我不知道你的抗體是什么牌子的，如果是三塔之類的抗體1:5000顯然是抗體的濃度太低，可以加大濃度，三塔的抗體一般我都用到1:1000/500，即使是AbCOM，cell signaling你的濃度也低，說明書只能說在最佳條件 ...

三塔抗體是哪個(gè)公司的啊？我用的是invitrogen公司的抗體，我下次增加濃度試一試。一抗封閉時(shí)不需要震蕩么？那要怎么在4度條件下進(jìn)行啊，我們實(shí)驗(yàn)室沒有層析室，只有4度冰箱。
還有抗體是用blocking buffer稀釋還是用PBS稀釋啊，我這兩個(gè)說明書有沖突。
還有你們的顯色液是什么配方啊，能不能具體一點(diǎn)，謝謝��！

[ Last edited by 爛鐵 on 2011-5-26 at 14:19 ]

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6樓2011-05-26 14:10:32

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西瓜

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爛鐵(金幣+2): 2011-05-29 11:26:06

引用回帖:

Originally posted by 爛鐵 at 2011-05-26 14:10:32:
三塔抗體是哪個(gè)公司的��？我用的是invitrogen公司的抗體，我下次增加濃度試一試。一抗封閉時(shí)不需要震蕩么？那要怎么在4度條件下進(jìn)行啊，我們實(shí)驗(yàn)室沒有層析室，只有4度冰箱。
還有抗體是用blocking buffer ...

三塔應(yīng)該是Santa Cruz吧。也是這方面的大公司啦。

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7樓2011-05-26 14:39:35

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西瓜and華華

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

我覺得你的一抗稀釋濃度太大了，你應(yīng)該做一個(gè)濃度梯度。第二：一抗封閉的時(shí)候你可以先在37度搖1-2h，然后放到4度冰箱過夜，這樣是沒有問題的哦。第三：顯色液你可以選擇Santa Cruz公司的ECL化學(xué)發(fā)光試劑，過程很簡(jiǎn)單，可以參考說明書，主要是沒有DAB那么毒，DAB有潛在的致癌性。以上供你參考，希望你實(shí)驗(yàn)成功。

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8樓2012-04-10 16:07:40

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