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[交流]
關(guān)于Western blot的抗體孵育階段
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Western blot 麗春紅染色已經(jīng)確定轉(zhuǎn)膜成功了，但是孵育后顯色沒(méi)有條帶。 我介紹一下我的實(shí)驗(yàn)過(guò)程： 一抗：Anti-His-HRP 二抗：HRP-Rabbit-Anti-Mouse lgG 一抗，二抗都是用封閉液按1:5000稀釋 使用的溶液如下（按照抗體說(shuō)明書配制的）： PBS  137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4PBST PBS +0.05% Tween-20,v/v)Blocking buffer PBST + 5% nonfat, dry milk, w/v)孵育時(shí)，我把膜放到一個(gè)塑料樣品袋中，然后加入抗體稀釋劑，一抗過(guò)夜孵育，二抗孵育一小時(shí)，這樣在樣品袋中孵育是不是不利于抗體與膜上蛋白的結(jié)合，對(duì)孵育效果產(chǎn)生影響？怎樣結(jié)合效果才好呢？ 顯色步用的是 3%的4-氯-1-萘酚+30%雙氧水+50mM的Tris-Hcl 室溫下浸泡震蕩大約30分鐘（也是根據(jù)抗體說(shuō)明書上面的方法）。 希望大家?guī)椭。?br /> [ Last edited by 爛鐵 on 2011-5-25 at 14:22 ] |
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西瓜
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雪山飛狐7233
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+5, EPI+1): 很有經(jīng)驗(yàn)，明顯是專家！P.S. 三塔是指Santa Cruz吧？ 2011-05-26 12:33:21
爛鐵(金幣+10): 2011-05-26 14:10:40
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+5, EPI+1): 很有經(jīng)驗(yàn)，明顯是專家！P.S. 三塔是指Santa Cruz吧？ 2011-05-26 12:33:21
爛鐵(金幣+10): 2011-05-26 14:10:40
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1. 我不知道你的抗體是什么牌子的，如果是三塔之類的抗體1:5000顯然是抗體的濃度太低，可以加大濃度，三塔的抗體一般我都用到1:1000/500，即使是AbCOM，cell signaling你的濃度也低，說(shuō)明書只能說(shuō)在最佳條件下才能有效（這種條件一般都不具備）。還有是不是能有個(gè)陽(yáng)性結(jié)果作為對(duì)照（比如別人做出過(guò)來(lái)），當(dāng)然抗體的批號(hào)要一致的。 2. 一抗封閉過(guò)夜最好在4度層析室或者層析柜里進(jìn)行，如果在室溫會(huì)嚴(yán)重影響抗體的效價(jià)。 3. 二抗封閉時(shí)間應(yīng)該超過(guò)二小時(shí)，可以在室溫進(jìn)行。 4. 一抗， 二抗封閉之前應(yīng)該用TBST(你的應(yīng)該是PBST)洗3次，10min/次。 5. 顯色我們用自配的 PCA Lum 1M Tris-Hcl(pH8.5) H2O2 H2O 個(gè)人感覺(jué)非常好用。 [ Last edited by 雪山飛狐7233 on 2011-5-26 at 06:00 ] |
4樓2011-05-26 05:57:14
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