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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 采用巢式PCR擴增
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睡著數(shù)綿羊銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
采用巢式PCR擴增
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最近一直用巢式PCR擴增目的片段，P了好久就不出來，想聽聽各位蟲蟲的建議 外側(cè)引物的TM值分別為63.3、67.1 內(nèi)側(cè)引物的TM值分別為51.2、53.0（不算酶切位點的TM值） 71.2、72.2（包括酶切位點的TM值） 用什么條件P會好些？  |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+6, EPI+1): good 2011-05-30 12:45:54
睡著數(shù)綿羊(金幣+2): 說的很詳細，非常感謝！ 2011-05-30 15:35:09
dhd997(金幣+6, EPI+1): good 2011-05-30 12:45:54
睡著數(shù)綿羊(金幣+2): 說的很詳細，非常感謝！ 2011-05-30 15:35:09
| 具體條件我想應該需要做梯度才能確定呢。。以前我也碰到過類似問題，我的解決辦法是外側(cè)引物首先用較低的溫度去P，不去管它的非特異性有多強，只要控制循環(huán)數(shù)過少的引入PCR過程中帶來的突變即可。。。然后利用外側(cè)PCR產(chǎn)物直接做模板來做內(nèi)側(cè)PCR，我是做一個梯度，尋找最合適的溫度來做！一般來說內(nèi)側(cè)引物與你外側(cè)產(chǎn)物的特異性結(jié)合應該會較強些。。基本上出結(jié)果都和特異性的出現(xiàn)目的條帶。。。。如果還是不出結(jié)果的話。。當然在排除了引物的前提下，模板量是不是很低呢？是RNA樣品？還是分離的mRNA反轉(zhuǎn)出的cDNA,總之，如果做了好多次了還不出的話，我認為PCR本身程序和流程問題不大，引物和模板才是關鍵，引物一般來說也不會出現(xiàn)問題，但還是建議核對一遍。。。模板嗎確定的方法很多。。如果RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA也是需要確定RNA質(zhì)量的。。如果mRNA量較低的話還是沒法克隆出目的片段滴！當然前提下是確實在提取的RNA中有mRNA的表達！有些組織或細胞一種mRNA表達量是很低的，需要刺激才能產(chǎn)生。�；蛘吒纱嗵醡RNA增大模板的量。。以前做過一段片段，一直沒辦P出來，文獻報道也是這個組織當中，最后我直接提該組織的癌細胞系（畢竟癌細胞好多蛋白都大量表達，部分mRNA水平也較高），幸運的是獲得的沒有任何突變。。。說的挺亂的，不知道能不能幫到你捏！ |
2樓2011-05-30 11:07:48
睡著數(shù)綿羊
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2011-05-30 15:36:22
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elapse1113
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5樓2015-07-09 19:32:14
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