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睡著數(shù)綿羊銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
采用巢式PCR擴(kuò)增
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最近一直用巢式PCR擴(kuò)增目的片段，P了好久就不出來(lái)，想聽(tīng)聽(tīng)各位蟲(chóng)蟲(chóng)的建議 外側(cè)引物的TM值分別為63.3、67.1 內(nèi)側(cè)引物的TM值分別為51.2、53.0（不算酶切位點(diǎn)的TM值） 71.2、72.2（包括酶切位點(diǎn)的TM值） 用什么條件P會(huì)好些？  |
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【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+6, EPI+1): good 2011-05-30 12:45:54
睡著數(shù)綿羊(金幣+2): 說(shuō)的很詳細(xì)，非常感謝！ 2011-05-30 15:35:09
dhd997(金幣+6, EPI+1): good 2011-05-30 12:45:54
睡著數(shù)綿羊(金幣+2): 說(shuō)的很詳細(xì)，非常感謝！ 2011-05-30 15:35:09
| 具體條件我想應(yīng)該需要做梯度才能確定呢。。以前我也碰到過(guò)類(lèi)似問(wèn)題，我的解決辦法是外側(cè)引物首先用較低的溫度去P，不去管它的非特異性有多強(qiáng)，只要控制循環(huán)數(shù)過(guò)少的引入PCR過(guò)程中帶來(lái)的突變即可。。。然后利用外側(cè)PCR產(chǎn)物直接做模板來(lái)做內(nèi)側(cè)PCR，我是做一個(gè)梯度，尋找最合適的溫度來(lái)做！一般來(lái)說(shuō)內(nèi)側(cè)引物與你外側(cè)產(chǎn)物的特異性結(jié)合應(yīng)該會(huì)較強(qiáng)些。。基本上出結(jié)果都和特異性的出現(xiàn)目的條帶。。。。如果還是不出結(jié)果的話。。當(dāng)然在排除了引物的前提下，模板量是不是很低呢？是RNA樣品？還是分離的mRNA反轉(zhuǎn)出的cDNA,總之，如果做了好多次了還不出的話，我認(rèn)為PCR本身程序和流程問(wèn)題不大，引物和模板才是關(guān)鍵，引物一般來(lái)說(shuō)也不會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，但還是建議核對(duì)一遍。。。模板嗎確定的方法很多。。如果RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA也是需要確定RNA質(zhì)量的。。如果mRNA量較低的話還是沒(méi)法克隆出目的片段滴！當(dāng)然前提下是確實(shí)在提取的RNA中有mRNA的表達(dá)！有些組織或細(xì)胞一種mRNA表達(dá)量是很低的，需要刺激才能產(chǎn)生。�；蛘吒纱嗵醡RNA增大模板的量。。以前做過(guò)一段片段，一直沒(méi)辦P出來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道也是這個(gè)組織當(dāng)中，最后我直接提該組織的癌細(xì)胞系（畢竟癌細(xì)胞好多蛋白都大量表達(dá)，部分mRNA水平也較高），幸運(yùn)的是獲得的沒(méi)有任何突變。。。說(shuō)的挺亂的，不知道能不能幫到你捏！ |
2樓2011-05-30 11:07:48
睡著數(shù)綿羊
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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3樓2011-05-30 15:36:22
4樓2013-05-16 22:10:50
elapse1113
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5樓2015-07-09 19:32:14
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