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yanhui8558金蟲 (小有名氣)
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[求助]
重疊pcr\跳躍pcr的問題
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我現(xiàn)在在進(jìn)行重疊pcr，想要把一段基因中間的內(nèi)含子去除，上游片段1600左右，下游片段500左右，先分別p出上下游片段，然后進(jìn)行重疊延伸步驟。實(shí)驗(yàn)條件如下： 中間上片段下引物和下片段上引物重疊區(qū)域大概50個(gè)bp，先不加入引物，讓上下游引物自連，用的是pcr混合物，pcr條件： 94度3分鐘，94度45秒，40度30秒，72度，1分40秒，72度10分鐘，2-4步循環(huán)10次，然后加入上片段上引物和下片段下引物，pcr條件： 94度3分鐘，94度45秒，50度30秒，72度，2分，72度10分鐘，2-4步循環(huán)30次. 延伸溫度也做過(guò)50-65的梯度，也加入過(guò)DMSO 試驗(yàn)過(guò)， 可是一直沒有成功，忘各位大俠指導(dǎo)，或者可以指出可能是哪方面的問題啊，感激不盡  |
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7樓2011-06-25 20:41:50
【答案】應(yīng)助回帖
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yanhui8558(金幣+1): 2011-06-23 17:01:15
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-06-23 19:20:26
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分段的上下片段都是PCR產(chǎn)物，濃度很高的，但是在第二輪的擴(kuò)增中其實(shí)就是個(gè)模板的作用，千萬(wàn)不要加太多了，加多了就把第二輪的引物全部飽和掉了，因?yàn)椴涣私饩唧w情況，也不好建議加多少，方便的話，做個(gè)梯度試試。 另外，分段的上下片段在做第二輪之前，稍微純化下，把第一次PCR之后的殘留引物，副產(chǎn)物什么的去掉，避免干擾第二輪的擴(kuò)增。 試試看吧！ |
2樓2011-06-23 16:53:04
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3樓2011-06-23 17:00:32
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4樓2011-06-23 20:40:36
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5樓2011-06-24 18:46:36
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6樓2011-06-24 19:38:55
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8樓2011-06-26 10:35:22
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-06-29 10:54:14
西瓜(金幣+3): 鼓勵(lì)交流 2011-06-29 10:54:14
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先提個(gè)問題，樓主的基因已經(jīng)克隆到載體了么？ 如果長(zhǎng)的片段已經(jīng)克隆到載體，而且只需要去除一個(gè)內(nèi)含子的話，可以直接在你克隆好的載體的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，反向擴(kuò)增，然后平末端連接�？赡芡嘶鸬臅r(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)，不過(guò)這樣應(yīng)該沒有問題。 只是提個(gè)建議。  |
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yanhui85589樓2011-06-29 09:47:01
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10樓2011-06-30 13:51:06
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