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[求助]
western和PCR選擇問(wèn)題
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| 做細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，想測(cè)定caspase-3,9蛋白，想問(wèn)下是用半定量PCR還是western對(duì)其進(jìn)行測(cè)定比較好？是不是都是說(shuō)明凋亡問(wèn)題，哪個(gè)更好一點(diǎn)，還是其中一個(gè)用PCR另一個(gè)用western？請(qǐng)?jiān)敿?xì)說(shuō)明一下二者的區(qū)別，測(cè)定后分別能說(shuō)明的問(wèn)題！新手請(qǐng)教高手幫忙��！ |
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terry130
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
癟(金幣+3): 2011-06-30 19:18:27
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檢測(cè)凋亡的話用PCR沒用，mRNA水平的變化不能直接聯(lián)系到凋亡水平上。你需要做更直接的檢測(cè)，比如LS說(shuō)的caspase3 cleavage實(shí)驗(yàn)。 除此之外，還有很多其他手段檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 比如roche的 Cell death Elisa 試劑盒 酶學(xué)檢測(cè)來(lái)測(cè)定caspase 3 activity（這個(gè)也有專門的試劑盒） 或者更直接點(diǎn)用凋亡敏感的染料直接染細(xì)胞 如PI、ANNEXIN V等，直接鏡檢或者上流式細(xì)胞儀都可以。 現(xiàn)在的文章中比較主流的數(shù)據(jù)都是一些試劑盒或者是流式的數(shù)據(jù)。這些比較可信。 |
3樓2011-06-30 07:45:01
cdl007
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, EPI+1): 2011-06-30 07:42:45
癟(金幣+2): 2011-06-30 19:18:32
dhd997(金幣+5, EPI+1): 2011-06-30 07:42:45
癟(金幣+2): 2011-06-30 19:18:32
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Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。 一般檢測(cè)凋亡要有pro-caspase3（32KD）減少的趨勢(shì)，活化caspase3（17KD）增加的趨勢(shì)。這是指western PCR 需要做一下的，但是結(jié)果不一定和western的一致。因?yàn)閏aspase的變化主要是蛋白的活化。 caspase9 買相應(yīng)抗體即可 |
2樓2011-06-30 06:57:30
4樓2011-06-30 10:05:28
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謝謝，我現(xiàn)在在設(shè)計(jì)我的試驗(yàn)方法，就是想讓方法更豐富一些，想從線粒體凋亡途徑說(shuō)明凋亡，所以會(huì)檢測(cè)caspase家族蛋白，你說(shuō)的雙染這個(gè)我也做，還有TUNEL，這兩個(gè)我會(huì)選其中一個(gè)做。我看好多文章都做了caspase或者bcl-2以及其他一些相關(guān)蛋白的mRNA檢測(cè)，所以我也想增加PCR這個(gè)方法，可以代替caspase的western檢測(cè)。因?yàn)槲疫�有其他蛋白做western，不想都是western這一個(gè)方法。 |
5樓2011-06-30 10:12:15
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