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bear0329金蟲 (正式寫手)
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[求助]
真菌ITS序列PCR擴(kuò)增 求助
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提取到土壤DNA后進(jìn)行真菌ITS序列PCR擴(kuò)增，用的引物是ITS1F/ITS4R 做了溫度梯度PCR，退火溫度從45℃——65℃，檢測結(jié)果顯示，非特異性條帶多，目的產(chǎn)物產(chǎn)量不高，見下圖 該如何優(yōu)化PCR體系和程序？請各位蟲友提供寶貴意見，先謝謝啦！ PCR體系： 總體積 30 10×buffer 3 dNTP 1.5 引物 1 taq EX 0.3 BSA 0.2 模板 1 水 22 程序： 94℃ 4min 94℃ 1min 45℃~65℃ 45s 72℃ 90s 72℃ 10min 32個(gè)循環(huán) |
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 土壤真菌 | 【分子生物】EPI帖 |
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bear0329
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2樓2011-07-04 10:01:44
beautybanana
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, EPI+1): 2011-07-04 18:03:59
bear0329(金幣+2): 我是做多態(tài)性分析的，不是做鑒定，里面應(yīng)該有很多的ITS序列，謝謝啊 2011-07-04 22:01:24
bear0329(金幣+1): 2011-07-06 15:13:16
dhd997(金幣+5, EPI+1): 2011-07-04 18:03:59
bear0329(金幣+2): 我是做多態(tài)性分析的，不是做鑒定，里面應(yīng)該有很多的ITS序列，謝謝啊 2011-07-04 22:01:24
bear0329(金幣+1): 2011-07-06 15:13:16
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你是不是要做菌種的ITS序列的鑒定呢？如果是的話，我把我做過的告訴你，如果不是的就算了哇~ ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’ PCR Amplification reaction system（50μl） ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2 5.0μl dNTPs(2.5mM) 1.0μl Primer5’ 2.0μl Primer3’ 2.0μl DNA template 1.0μl Taq DNA ploymerase(5U/μl) 0.5μl 反應(yīng)程序如下： 94℃ for 5 minutes denaturalization 94℃ for 45 seconds denaturation 52℃ for 45 seconds annealing 72℃ for 1min30sec extension 2 35 72℃ for 10 minutes final extension 大概500bp左右 |
3樓2011-07-04 16:17:18
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西瓜(金幣+5): 鼓勵(lì) 2011-07-05 00:31:55
西瓜(金幣+5): 鼓勵(lì) 2011-07-05 00:31:55
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樓主提取土壤樣品的DNA，里面的微生物是非常豐富的，當(dāng)然也是含有多種真菌的，使用真菌通用引物來擴(kuò)增，照理說應(yīng)該得到多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，他們的ITS的長度相互之間不會(huì)變化太大，所以跑DNA電泳的時(shí)候可能會(huì)在相近的地方有多條帶。（現(xiàn)在論壇不能上傳和下載文件，連帶著看不到樓主貼出來的圖。）所以不存在非特異性擴(kuò)增的說法。理應(yīng)是多條帶的，只得到一條帶才奇怪，無論是做什么退火溫度梯度，結(jié)果都不會(huì)有實(shí)質(zhì)性改變。 你的PCR體系總體積是29微升，引物只有1微升，是不是想寫正反向引物各1微升？體系和我用的一樣，程序也沒有任何問題，除了退火溫度之外，其余的和我的一樣。 beautybanana用的是ITS5，其實(shí)也沒問題，大同小異。ITS1和5都是在18S上的，ITS4在28S上，ITS1和4或者5和4都可以用，擴(kuò)增得到的可變區(qū)都是完整的兩個(gè)。至于長度就難說了，各種不同種屬的真菌得到的長度可能會(huì)不同，不局限于500bp。 |
4樓2011-07-04 19:06:39
bear0329
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5樓2011-07-04 22:03:25
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): 厲害厲害！ 2011-07-05 00:31:39
bear0329(金幣+2): 謝謝你的建議啊~ 2011-07-05 07:57:12
bear0329(金幣+1): 2011-07-06 15:13:32
西瓜(金幣+5, EPI+1): 厲害厲害！ 2011-07-05 00:31:39
bear0329(金幣+2): 謝謝你的建議啊~ 2011-07-05 07:57:12
bear0329(金幣+1): 2011-07-06 15:13:32
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被我猜中了，你發(fā)帖的時(shí)候我就在想你的意圖，現(xiàn)在果然沒猜錯(cuò)。 由于你的序列長度相差可能不大，跑電泳極難分得開，所以不能回收。再說了，即使是分得很開，也存在兩個(gè)菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物長度完全相同的隱患，所以是得不到單一產(chǎn)物的。 但是你可以將擴(kuò)增產(chǎn)物都回收（保持產(chǎn)物的多樣性才能達(dá)到你分析多樣性的目的），全部與載體連接，得到一批含有外源片段的克隆子，轉(zhuǎn)化載體到宿主內(nèi)（一般選用大腸桿菌），涂板得到單菌落，這就是可能含有各不相同的ITS序列的克隆子了，將這些克隆子分別培養(yǎng)提取質(zhì)粒送測序，就能得到很多菌株的ITS序列，進(jìn)行多樣性分析了。 當(dāng)然這會(huì)耗費(fèi)一筆錢，但這是必須付出的代價(jià)。 |
6樓2011-07-04 23:20:18
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