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qingtingzhe銀蟲 (正式寫手)
步行者
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[求助]
請教二維電泳高手，如回答的好，另有重賞�。。。�
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我現(xiàn)在做一株紅球菌二維電泳，研究其受多環(huán)芳烴誘導(dǎo)的差異蛋白，通過差異蛋白尋找降解多環(huán)芳烴的降解基因�，F(xiàn)在遇到一些問題： （1）超聲破碎的功率和時(shí)間選擇。由于紅球菌是革蘭氏陽性菌，破壁比較難，條件怎樣選擇？ （2）影響蛋白樣品制備的因素有哪些？有哪些注意事項(xiàng)，例如怎么除鹽，怎么盡量減少蛋白的損失。 （3）下面是我從文獻(xiàn)中看到的方法，請?zhí)嵝┙ㄗh： （1）收集菌體。 （2）超聲破碎。 （3）除去細(xì)胞碎屑和DNA。通過一步加入精胺，290000g高速離心。 （4）通過透析除去無機(jī)鹽和小分子物質(zhì)。 （5）-20度保存。 |
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2樓2011-07-06 00:16:21
yangqi
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3樓2011-07-06 09:42:42
qingtingzhe
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4樓2011-07-07 09:36:16
superboring
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5樓2011-07-07 16:12:02
yangqi
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【答案】應(yīng)助回帖
qingtingzhe(金幣+20): 幫助挺大的 2011-07-07 21:04:11
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不用說請教，呵呵，我做得也不是很多。 1.超聲時(shí)間間隔十分鐘，冰上超聲。但是效果不是很好，可能我做的細(xì)菌壁太厚。最近準(zhǔn)備用溶菌酶試試。 2.沒有用過超速離心，我一般是13200r離心30min。好像超速離心機(jī)可以做不同蛋白的分級(jí)，我以前本來打算做細(xì)胞膜蛋白，就需要超速離心機(jī)。 3.透析可以除鹽，還可以純化，但是如果蛋白量本來不大，損耗是比較大的。當(dāng)然純度會(huì)比丙酮沉淀的高一些。要不你加大提取的量，透析之后，用冷凍干燥離心的方法減少體積，這樣可以提高濃度。PS：我也沒用過透析，師兄師姐都不建議用。 4.另外，打算跑雙向的話，建議先用核酸酶處理下，防止橫條紋的產(chǎn)生。 提蛋白時(shí)，整個(gè)過程保持低溫、注意添加蛋白酶抑制劑....... 不然全降解完了。 |
6樓2011-07-07 16:27:03
qingtingzhe
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7樓2011-07-07 21:00:14
qingtingzhe
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8樓2011-07-07 21:24:49
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【答案】應(yīng)助回帖
qingtingzhe(金幣+10): 謝謝了 2011-07-09 16:01:30
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我加的是PPMV，用乙醇或異丙醇溶解成終濃度為10mmol的溶液，分裝小管，-20℃保存。用的時(shí)候，我是憑經(jīng)驗(yàn)加幾微升，加到研磨后的提取緩沖液中，一般是一毫升加五微升的樣子，如果我打算提取久一點(diǎn)，就會(huì)多加一點(diǎn)點(diǎn)。離心用TCA/丙酮沉淀的時(shí)候，我加的是終濃度為0.07%的β-巰基乙醇，這個(gè)也有抑制蛋白降解的作用。以后每次用丙酮洗滌的時(shí)候，都要加。 EDTA的終濃度好像要加到2mM效果會(huì)好些~~~ |
9樓2011-07-08 09:06:33
yangqi
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10樓2011-07-08 09:07:25
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