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設(shè)計(jì)引物時酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基的問題
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我想在畢赤酵母表達(dá)蛋白，用的是pPTC9K，因?yàn)槟繕?biāo)蛋白中有SnaBI和EcoRI,所以只能用兩相鄰的AvrII和NotI酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物的時候找不到AvrII的保護(hù)堿基，求助。 同時也聽師兄說保護(hù)堿基的格式是有規(guī)定的（http://wenku.baidu.com/view/e596a5dba58da0116c1749bf.html參照這個表）。但我之前設(shè)計(jì)引物的時候都是隨便來的，像BamHI我只是象征性的添加幾個GC，只要無發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體就行了，而且也都能p出來。所以我困惑了，保護(hù)堿基到底有啥要求？必須按照那個表來，堿基數(shù)目及排列都必須一樣？ 畢赤酵母組氨酸偏愛密碼子為CAC，為減小引物Tm值我選用CAT可否，會影響表達(dá)效率么？ 求高手指導(dǎo)，最好能給個QQ進(jìn)一步咨詢。。。 [ Last edited by 肉丸001 on 2011-7-7 at 19:28 ] |
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3樓2011-07-07 20:25:18
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
肉丸001(金幣+5): 謝謝。。 2011-07-07 20:23:56
dhd997(金幣+3): 2011-07-08 08:12:12
肉丸001(金幣+5): 謝謝。。 2011-07-07 20:23:56
dhd997(金幣+3): 2011-07-08 08:12:12
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保護(hù)堿基的問題，真的是隨便放幾個就ok了。有些特殊的酶需要比較長的保護(hù)堿基，但是一般常用的酶（您用的BamH I也是），放3個以上就可以了，可以調(diào)整堿基類型和數(shù)目，達(dá)到調(diào)整引物Tm值和GC含量的目的。 關(guān)于保護(hù)堿基那個表，最早好像是NEB搞出來的，造成了一些迷信。NEB以前的產(chǎn)品目錄是有那個表的，但是近年來的產(chǎn)品目錄都取消了，因?yàn)樗麄円惨庾R到?jīng)]必要糾結(jié)保護(hù)堿基。這個表，你可以看，如果發(fā)現(xiàn)你要用的酶活力都很低，那么你就把保護(hù)堿基加到5個以上，不放心可以照著表上的去做，但一般的酶加3個就夠用了。 后面的問題我不懂哈 |
2樓2011-07-07 19:50:59
天使托
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4樓2011-07-07 20:55:48
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5樓2011-07-07 21:56:16
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