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小雪sherry

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[交流] 酶切連接轉(zhuǎn)化

最近在做PET-28a與目的片段連接，首先目的片段是連T載體切下來的，然后把目的片段連到載體上，轉(zhuǎn)化得到的菌落特別少，兩三個(gè)，提質(zhì)粒大小不對(duì)，做了半年這個(gè)試驗(yàn)了，怎么都做不好，急啊。還有最近做目的片段連T載體，轉(zhuǎn)化后有藍(lán)白斑，挑取白斑，提質(zhì)粒，電泳大小也不對(duì)，怎么辦啊，各位大俠給個(gè)意見啊，自己做了半年多了，感覺手法沒問題，感受態(tài)一是買的，應(yīng)該也沒問題啊，為啥總做不好呢，快沒信心了

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1樓 2011-07-09 09:24:11

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yang0071

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dhd997(金幣+2): 提了好多問題，都很重要 2011-07-09 09:39:20
小雪sherry(金幣+2): 做了陽(yáng)性對(duì)照，確定感受態(tài)沒有問題，連接體系15微升，T4連接酶，我覺得這些都沒問題的啊，重新來一次吧 2011-07-11 07:56:58

做轉(zhuǎn)化時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照呢？感覺很多時(shí)候是不準(zhǔn)的

估計(jì)是連接效率低，連接體系是多少的？什么酶？時(shí)間？溫度？
轉(zhuǎn)化時(shí) 加液量多少？熱休克溫控？時(shí)間？

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2樓2011-07-09 09:37:02

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青菜小蟲

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1949stone(金幣+2): 小蟲很活躍啊鼓勵(lì) 2011-07-09 11:07:03
小雪sherry(金幣+1): 同樣的啊我也是這樣，連了好幾次了，每次都是長(zhǎng)了幾個(gè)菌落，很郁悶 2011-07-11 08:01:29

我覺得應(yīng)該是目的片段沒有連接上吧，我最近也在做這個(gè)實(shí)驗(yàn)，不過我們的感受態(tài)是自己制備的，我們是用inoue法制備的超級(jí)感受態(tài)，目的片段都連到T載體上了。但是從T載體上切下來的目的片段往PMC18 質(zhì)粒上也是不好連。

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3樓2011-07-09 09:53:07

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天使托

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小雪sherry(金幣+1): 恩恩有道理 2011-07-11 08:01:53

個(gè)人認(rèn)為應(yīng)該是連接的問題，你可以挑白色的單克隆進(jìn)行先PCR驗(yàn)證，如果能夠P出來，那么再提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證；

藍(lán)白斑篩選長(zhǎng)出來的單克隆不一定正確，挑白色單克隆劃到平板上，劃之前先在板子上涂一些X-Gal，這樣也可以排除假陽(yáng)性的。。。

祝實(shí)驗(yàn)順利！

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4樓2011-07-09 15:35:17

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空谷幽風(fēng)

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你片段用什么酶擴(kuò)的？記住用Taq酶擴(kuò)，千萬(wàn)別用高保真的酶，那樣擴(kuò)出來尾部是沒有A的，所以沒法連接T載體；T載體是買的還是自己做的？

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5樓2011-07-09 15:46:10

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jiangyhai

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dhd997(金幣+2): good 2011-07-09 18:20:11

T載體上的目的片段經(jīng)過測(cè)序沒？電泳質(zhì)粒通過大小判斷不太可靠，除非你的目的片段很大。不知道有沒有用T7引物進(jìn)行PCR鑒定。還有就是分析目的片段中的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)。表達(dá)載體的鑒定也可以通過菌落PCR的方法來初步判斷目的片段的插入情況。希望對(duì)你有幫助。

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6樓2011-07-09 15:48:36

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friya0910

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西瓜(金幣+2): 歡迎交流。我們實(shí)驗(yàn)室是菌落PCR不可靠……所以都用一種快速提質(zhì)粒的方法看大小，再挑大的質(zhì)粒去酶切驗(yàn)證。 2011-07-10 21:41:53

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Originally posted by 小雪sherry at 2011-07-09 09:24:11:
最近在做PET-28a與目的片段連接，首先目的片段是連T載體切下來的，然后把目的片段連到載體上，轉(zhuǎn)化得到的菌落特別少，兩三個(gè)，提質(zhì)粒大小不對(duì)，做了半年這個(gè)試驗(yàn)了，怎么都做不好，急啊。還有最近做目的片段連T載 ...

個(gè)人覺得提質(zhì)粒跑電泳看大小不太可靠，我一般都是先做菌落PCR，確定目的片段連進(jìn)去了，再提質(zhì)粒的！最保險(xiǎn)的還是測(cè)序驗(yàn)證一下比較好吧！

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7樓2011-07-10 19:16:16

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Originally posted by friya0910 at 2011-07-10 19:16:16:
個(gè)人覺得提質(zhì)粒跑電泳看大小不太可靠，我一般都是先做菌落PCR，確定目的片段連進(jìn)去了，再提質(zhì)粒的！最保險(xiǎn)的還是測(cè)序驗(yàn)證一下比較好吧！

我的片段是接近700了應(yīng)該能看出大小來的，我試試PCR吧，這樣可以省點(diǎn)試劑盒提質(zhì)粒

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8樓2011-07-11 08:05:47

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Originally posted by jiangyhai at 2011-07-09 15:48:36:
T載體上的目的片段經(jīng)過測(cè)序沒？電泳質(zhì)粒通過大小判斷不太可靠，除非你的目的片段很大。不知道有沒有用T7引物進(jìn)行PCR鑒定。還有就是分析目的片段中的限制內(nèi)切酶位點(diǎn)。表達(dá)載體的鑒定也可以通過菌落PCR的方法來初步 ...

T載體的我還沒有測(cè)過序，但是我用酶把片段從T載體上切下來了啊如果沒連上也應(yīng)該切不下來啊試試菌落pcr吧謝謝

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9樓2011-07-11 08:07:31

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Originally posted by 空谷幽風(fēng) at 2011-07-09 15:46:10:
你片段用什么酶擴(kuò)的？記住用Taq酶擴(kuò)，千萬(wàn)別用高保真的酶，那樣擴(kuò)出來尾部是沒有A的，所以沒法連接T載體；T載體是買的還是自己做的？

用的是TAKARA的Tag酶，T 載體還能自己做嗎，教教我吧，還省錢了

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10樓2011-07-11 08:09:13

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Originally posted by 青菜小蟲 at 2011-07-09 09:53:07:
我覺得應(yīng)該是目的片段沒有連接上吧，我最近也在做這個(gè)實(shí)驗(yàn)，不過我們的感受態(tài)是自己制備的，我們是用inoue法制備的超級(jí)感受態(tài)，目的片段都連到T載體上了。但是從T載體上切下來的目的片段往PMC18 質(zhì)粒上也是不好連。

不要喪失信心，多做幾次，菌落pcr的時(shí)候多挑幾個(gè)菌檢測(cè)，加油！

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11樓2011-07-11 08:46:20

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Originally posted by 小雪sherry at 2011-07-11 08:09:13:
用的是TAKARA的Tag酶，T 載體還能自己做嗎，教教我吧，還省錢了

你還是買成品的吧，自己做的質(zhì)量沒保證，再說商品化的也不值錢

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12樓2011-07-11 21:07:58

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