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wendaojue銅蟲 (著名寫手)
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[求助]
構(gòu)建載體后不表達(dá)
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| 做了好久，總算把載體構(gòu)建好了，測序都沒問題，但是就是不表達(dá)，很郁悶。想請教下，有什么原因會引起不表達(dá)嗎？ |
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lxj341401
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3樓2011-07-15 17:04:47
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2樓2011-07-15 16:50:15
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4樓2011-07-16 13:53:38
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, EPI+1): 專業(yè)，辛苦 2011-07-18 12:48:15
wendaojue(金幣+2): 2011-08-02 10:02:27
dhd997(金幣+5, EPI+1): 專業(yè)，辛苦 2011-07-18 12:48:15
wendaojue(金幣+2): 2011-08-02 10:02:27
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樓主所說的目的蛋白不表達(dá)是如何鑒定的？ 檢測一個蛋白是否表達(dá)包括，轉(zhuǎn)化子的鑒定，mRNA水平的檢測，蛋白水平的檢測包括液相色譜檢測，抗體檢測，質(zhì)譜檢測，蛋白活性檢測。不知道樓主是從哪個水平上得出的目的蛋白沒有表達(dá)這個結(jié)論。 蛋白不能正常表達(dá)原因很多，在真核表達(dá)中常出現(xiàn)的問題有，密碼子偏好性問題（這直接決定你的蛋白是否會順利正確的翻譯出來），mRNA穩(wěn)定性問題（宿主自身的防御機(jī)制是否會降解mRNA），還有你的蛋白穩(wěn)定性問題（蛋白表達(dá)過程中，溫度PH等條件的影響）。從宿主方面來講，你的目的蛋白對宿主的毒性問題，你的宿主是否會產(chǎn)生能降解目的蛋白的酶，還有就是一個宿主表達(dá)蛋白的分子量是有上限和下限的，所以你的蛋白的大小是否適合于你的宿主來表達(dá)。另外，還有蛋白的折疊問題等等。 樓主說做了酶切和測序都是正確的，這只能說明你的質(zhì)粒構(gòu)建是正確的。而轉(zhuǎn)入宿主之后，質(zhì)粒是與宿主基因組整合還是獨(dú)立的？是單拷貝還是多拷貝？以及如何進(jìn)行的篩選?這些環(huán)節(jié)都會直接影響目的蛋白的表達(dá)。我曾經(jīng)做過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，由于我的目的蛋白很小，表達(dá)量很低，又沒有對應(yīng)的抗體，表達(dá)初期只能靠抑菌活性來檢測，結(jié)果一直檢測不到活性，后來打了質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)目的蛋白已經(jīng)表達(dá)了，只是表達(dá)量太低。后來從高產(chǎn)菌株篩選入手，結(jié)果得到了比較理想的效果。 樓主提到CMV啟動子，貌似是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的吧，由于本人沒有親自做過細(xì)胞表達(dá)，所以以上為一點(diǎn)淺薄的經(jīng)驗(yàn)，希望能對您有幫助。 |
5樓2011-07-16 20:13:21
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