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asdfghjkl-00新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
克隆假陽(yáng)性的問(wèn)題
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最近一直在做克隆，藍(lán)白篩選長(zhǎng)的白斑也不少，送去測(cè)序也有系列，但是一比對(duì)，就是載體序列，請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事啊？是陽(yáng)性率太低了嗎？是不是連接效率太低導(dǎo)致的陽(yáng)性率也低？怎么提高連接效率��？各位高手們幫忙解決一下吧。。。。 [ Last edited by asdfghjkl-00 on 2011-7-31 at 10:10 ] |
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gwbk
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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4樓2011-07-31 22:47:52
【答案】應(yīng)助回帖
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dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 非常熱心，破格獎(jiǎng)勵(lì) 2011-07-31 17:51:27
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 非常熱心，破格獎(jiǎng)勵(lì) 2011-07-31 17:51:27
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既然有藍(lán)白色菌斑，說(shuō)明可以轉(zhuǎn)進(jìn)質(zhì)粒去。測(cè)序不成功，結(jié)果是空載體說(shuō)明是假陽(yáng)性。樓主是不是用的試劑盒？現(xiàn)在試劑盒載體自連的概率是很小的。 問(wèn)題1：樓主不進(jìn)行白色菌斑的PCR鑒定以及雙酶切鑒定嗎？ 問(wèn)題2：樓主的目的片段是多少？連接多少時(shí)間？ 建議：1，在測(cè)序之前進(jìn)行陽(yáng)性菌株的鑒定。 2，如果是長(zhǎng)片段的話(huà)，建議連接過(guò)夜，可以提高連接效率。 希望樓主盡快找到問(wèn)題~~實(shí)驗(yàn)順利  |
2樓2011-07-31 15:20:11
mayonghong
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【答案】應(yīng)助回帖
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1949stone(金幣+3): 學(xué)習(xí)下 2011-07-31 20:47:23
1949stone(金幣+3): 學(xué)習(xí)下 2011-07-31 20:47:23
| 在測(cè)序前建議先進(jìn)行菌液PCR進(jìn)行驗(yàn)證，但是有的時(shí)候菌液PCR容易假陽(yáng)性，也可以提質(zhì)粒，電泳進(jìn)行驗(yàn)證，現(xiàn)在酶連都是試劑盒，我們一般酶連時(shí)間：16℃酶連4h，或者4℃酶連過(guò)夜，還有酶連時(shí)間也不是越長(zhǎng)越好，另外做實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)手法也很重要，一定要注意細(xì)節(jié)問(wèn)題。 |
3樓2011-07-31 20:28:01
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