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[求助]
PCR擴增中GC含量退火溫度的問題
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| 請問一下，要擴一個基因3.5k，GC含量為45%，可是有一條引物的GC含量是63%，另一條為40%，Tm值分別為71°和58°（生工合成單上的溫度），我用Takara 的primeSTAR HS擴，第一次以基因組為模板擴用56°擴出來了，很亮，切膠回收后，做模板，同樣條件再擴，就是彌散的一片，重復(fù)幾次都這樣，怎么辦呢，我沒有基因組了，再提一次很麻煩的。。。 |
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blackrose8089
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
1949stone(金幣+3): 鼓勵 2011-08-15 11:21:20
tingl0087(金幣+1): 恩，有道理，一會重新做個PCR試試~謝謝了~ 2011-08-15 16:27:06
1949stone(金幣+3): 鼓勵 2011-08-15 11:21:20
tingl0087(金幣+1): 恩，有道理，一會重新做個PCR試試~謝謝了~ 2011-08-15 16:27:06
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以前遇到過類似的問題,也是takara的primer star，原因可能有兩個： 1 模板濃度太大，以前曾經(jīng)以質(zhì)粒為模板擴過，原液濃度是測序后的樣品，發(fā)現(xiàn)在稀釋到一萬倍后才有十分特異的條帶，100，1000倍的都像地毯一樣，泳道彌散。 2 模板質(zhì)量不是太好，primer star的保真性好，可以擴增長片段，以前擴過7.3k的片段，但同時它對模板質(zhì)量要求也高，建議樓主看一下回收的產(chǎn)物質(zhì)量如何！ 供樓主參考！ |
2樓2011-08-15 08:55:46
xbl3688
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3樓2011-08-15 09:12:15
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