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雙酶切的片段不見(jiàn)了？
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| 向大家請(qǐng)教一個(gè)問(wèn)題，我最近在做轉(zhuǎn)化，用的是pET-30a，連的片段為400bp，酶切位點(diǎn)為kpnI和HindIII，但是雙酶切后，卻沒(méi)找到400的片段。之后我又分別做了單酶切，對(duì)照驗(yàn)證兩個(gè)酶都有效的切開(kāi)了質(zhì)粒，但是就是沒(méi)有400bp的目的片段，很糾結(jié)，很糾結(jié)，望各位蟲友搭救！�。。≒S：我用載體通用引物擴(kuò)增的時(shí)候能擴(kuò)出來(lái)720的片段，說(shuō)明目的片段應(yīng)該連上了） |
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lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
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2樓2011-08-26 19:47:53
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lingbi
銀蟲 (正式寫手)
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4樓2011-08-29 21:18:16
瓶?jī)夯?/font>
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5樓2011-08-30 13:28:51
jushi0619
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6樓2011-08-30 14:58:43
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 2011-08-30 17:12:00
ybs007(金幣+5): 感激不盡 2011-08-31 10:18:26
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): 2011-08-30 17:12:00
ybs007(金幣+5): 感激不盡 2011-08-31 10:18:26
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其實(shí)照樓主所說(shuō)已經(jīng)得到了重組載體，而且你基本已經(jīng)確定正確了，就是需要一張perfect的酶切圖把？ 其實(shí)照你所說(shuō)的，因?yàn)槟愕妮d體上連接的片段是400bp，相對(duì)較小一些，你的載體大小5.4kb,是基因的將近14倍，酶切的話應(yīng)該選擇一個(gè)稍微大一點(diǎn)的體系，至少得20ul以上，而且你要確保你的重組載體量足夠大，就是電泳顯示比較亮，這樣你酶切之后才會(huì)看到那條400bp比較小的條帶。。。如果重組載體量很少，那么直接over，不用酶切了，肯定看不到的。。。 我原來(lái)也遇到過(guò)類似的問(wèn)題，你可以參看我這篇帖子，相信你一看就知道該如何去做了！ http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3357650 祝好運(yùn)！ |
7樓2011-08-30 15:35:10
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