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青菜小蟲銀蟲 (著名寫手)
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[求助]
PCR ， 雙酶切，連接問題
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| 請問一下PCR用高保真的酶P 3000多的片段，突變率大嗎？還有PCR 的目的片段純化后，雙酶切效果如何？把兩個目的片段同時往載體上連的話，一個片段是3000bp，一個是2000bp，載體5380bp，用的是TAKARA的連接試劑盒，兩個片段的合適比例是多少��？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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zhangxn2010
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7樓2011-08-27 17:21:32
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【答案】應助回帖
青菜小蟲(金幣+5): 謝謝你的解答。 2011-08-27 14:26:48
1949stone(MolEPI+1): 這個要epi 13k的 可以么？ 2011-08-27 21:22:53
1949stone(MolEPI+1): 這個要epi 13k的 可以么？ 2011-08-27 21:22:53
我們實驗室擴增長片段常用的是Takara的primer star，有記錄的是7.3k。沒錯堿基，樓主可以試一下！目的片段純化后如果量足夠大，酶切也沒問題的，別忘了加上保護堿基。兩個大片段往載體上連接難度可能大些，但也能成功，曾經(jīng)連接過14k，1k，700bp的和7.3k，3.8k，700bp的能連上但費了不少功夫！關于比例這個樓主最好咨詢一下技術顧問，偶也沒太多的經(jīng)驗，就是多做了些連接轉(zhuǎn)化就搞定了！ |
2樓2011-08-27 12:08:07
青菜小蟲
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3樓2011-08-27 14:53:25
青菜小蟲
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4樓2011-08-27 14:57:28
blackrose8089
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【答案】應助回帖
★ ★ ★
1949stone(金幣+3): 牛人 支持 想你學習 2011-08-27 21:23:18
1949stone(金幣+3): 牛人 支持 想你學習 2011-08-27 21:23:18
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1 PrimeSTAR HS DNA Polymerase是兼具高保真性和高擴增效率的PCR用DNA聚合酶。因其具有極強的3’→5’Exonuclease活性而顯示出超群的校正功能，同時還具有優(yōu)于Taq DNA Polymerase的高擴增效率。制品中添加了在常溫狀態(tài)下能夠抑制DNA Polymerase活性及3’→5’Exonuclease活性的抗體，有效防止PCR反應前的引物錯配和引物消化。與最適反應Buffer配合使用，可以實現(xiàn)對廣泛靶序列的高保真性、高靈敏度、高特異性、高成功率的擴增，對于cDNA克隆等要求高保真的PCR反應發(fā)揮最強大的威力。使用本制品擴增得到的PCR產(chǎn)物幾乎都為平滑末端，經(jīng)磷酸化后可直接克隆于具有平滑末端的載體中。 2 GC含量高的話： PrimeSTARHS DNA Polymerase with GC Buffer適用于高保真擴增具有復雜二級結(jié)構(gòu)的DNA模板(GC rich、重復序列等)。PrimeSTARHS DNA Polymerase具有極強的3′→5′Exonuclease活性，顯示出超群的校正功能，同時還具有優(yōu)于Taq DNA Polymerase的高擴增效率。本制品對cDNA克隆等要求高保真的PCR反應能夠發(fā)揮強大威力，并能對高GC含量模板進行高效擴增。使用本制品擴增得到的PCR產(chǎn)物幾乎都為平滑末端，經(jīng)磷酸化后可直接克隆于具有平滑末端的載體中。 |
6樓2011-08-27 15:19:08
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8樓2011-08-27 19:47:35
zhangxn2010
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9樓2011-08-28 08:21:40
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10樓2011-08-28 09:17:34
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