rollandyoung

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[求助] 質(zhì)粒DNA提取成了這樣，請(qǐng)大家?guī)兔Ψ治鲆幌?

一、試驗(yàn)內(nèi)容：
1. 質(zhì)粒pCAMBIA1301DNA提取
2. 對(duì)提取的質(zhì)粒DNA根據(jù)質(zhì)粒圖譜上的酶切位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證性的酶切，所用酶Xho1。
3. 根據(jù)一篇已發(fā)表的論文所用的引物序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行驗(yàn)證性的PCR擴(kuò)增。
二、主要試驗(yàn)材料：含有質(zhì)粒的大腸桿菌（已經(jīng)液體LB培養(yǎng)基搖菌16小時(shí)）
三、方法：參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版方案一 SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA：小量制備
四、結(jié)果：1.質(zhì)粒DNA見(jiàn)電泳照片
2.酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示無(wú)酶切產(chǎn)物出現(xiàn)
3. PCR擴(kuò)增無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)
問(wèn)題：
綜合上述結(jié)果，使我對(duì)我提取的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量產(chǎn)生了疑問(wèn)，總結(jié)了以下問(wèn)題
1. 我知道正常的質(zhì)粒DNA電泳應(yīng)該能夠呈現(xiàn)出很亮且較寬的帶型，這種情況屬于正常嗎？大家是否以前也遇到過(guò)這樣的問(wèn)題，是怎樣解決的？
2. 質(zhì)粒DNA提取過(guò)程中有哪些需要注意的地方？
3. 提取質(zhì)粒DNA用到的試劑有特殊的要求和需要注意的地方嗎？
4. 除上述問(wèn)題外還有哪些需要注意和改進(jìn)的地方？

已經(jīng)被這個(gè)問(wèn)題困擾了整個(gè)假期了，嚴(yán)重地影響了下一步的試驗(yàn)進(jìn)程，故求助的心情十分之迫切，希望大家不吝賜教，在此先行謝過(guò)！

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1樓 2011-08-29 10:45:40

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keyasyie

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17樓: Originally posted by rollandyoung at 2011-09-02 12:32:40:
1. 之前按照說(shuō)明書(shū)的反應(yīng)體系我做過(guò)，電泳顯示無(wú)酶切片段。
2. buffer是按照說(shuō)明書(shū)的要求加的，質(zhì)粒DNA的量確實(shí)是多了一些，原因是我提的質(zhì)粒DNA就不亮，所以我把質(zhì)粒的反應(yīng)量提高了。
3. 繼續(xù)求助，呵呵！

不知道你用的什么公司的酶
一般來(lái)說(shuō)10X的BUFFER 20ul體系加2ul足夠了
質(zhì)粒DNA濃度低可以多提取幾次然后混在一起在濃縮純化一下
分子克隆上的方法很經(jīng)典老板沒(méi)錢就不用買試劑盒了
個(gè)人觀點(diǎn) 僅供參考希望對(duì)你有幫助

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24樓2011-09-03 17:39:15

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【答案】應(yīng)助回帖

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rollandyoung(金幣+10): 感謝你的幫助，祝實(shí)驗(yàn)順利！ 2011-08-29 16:25:01
西瓜(金幣+1): 熱心專家！ 2011-08-29 17:53:10

關(guān)于質(zhì)粒提取可以參考http://www.gaoyang168.com/bbs/viewthread.php?tid=3069255

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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?

2樓2011-08-29 15:41:09

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peace12039088

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dhd997(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2011-09-01 18:50:50

每次提的都這樣嗎？我也遇到過(guò)跑膠帶型很差的情況，但似乎酶切驗(yàn)證后，還是符合預(yù)期的。瓊脂糖膠跑的效果不好也有可能是膠本身的問(wèn)題。所以，建議酶切或PCR 驗(yàn)證一下。

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3樓2011-08-29 16:55:33

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pcr和酶切我全都做了，但是都沒(méi)做出來(lái)，正因?yàn)槿绱宋也艖岩墒琴|(zhì)粒的提取問(wèn)題，感謝你的建議。

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4樓2011-08-29 18:56:48

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linyanfei

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你可以買一個(gè)小型質(zhì)粒提取試劑盒試試，效果應(yīng)該比你這個(gè)要好吧

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5樓2011-08-29 20:27:47

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eileen8519

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買一個(gè)試劑盒用用，提質(zhì)粒方便快速！

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6樓2011-09-01 13:20:19

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zhangxn2010

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你的maker是多大？
感覺(jué)這個(gè)質(zhì)粒若為環(huán)狀超螺旋不會(huì)這么大

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一直向前！

7樓2011-09-01 13:26:00

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sfb1020

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我們實(shí)驗(yàn)室就用分子克隆的方法，沒(méi)有問(wèn)題的。你提的質(zhì)粒做RNA酶消化了嗎？酶消化后還要去除RNA酶，否則可能會(huì)對(duì)PCR和酶切有影響。

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8樓2011-09-01 16:27:55

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dhd997(金幣+3): good 2011-09-01 18:51:11

1、查了一下，你這個(gè)載體很大誒，8000-10000kD吧。你用的marker太小了，可以換一下1K(最大為10000kD)的marker。
2、抽質(zhì)粒跑膠圖帶的大小不是很準(zhǔn)確，單酶切后大小就準(zhǔn)確了。
3、你做了單酶切是什么結(jié)果啊，酶切條件可以拿出來(lái)看一下

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生活的樂(lè)趣在于善于發(fā)現(xiàn)美，學(xué)會(huì)欣賞美

9樓2011-09-01 16:56:29

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dhd997(金幣+2): good 2011-09-01 18:51:21

pCAMBIA1301是低拷貝的載體不太容易操作。提取質(zhì)粒時(shí)一定要用氯仿把中酚抽干凈以免影響限制性內(nèi)切酶和Taq酶的活性。

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10樓2011-09-01 17:21:28

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