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wanhscn木蟲 (職業(yè)作家)
哲學(xué)@草根
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【轉(zhuǎn)】我在SDS-PAGE中所犯的錯(cuò)誤，歡迎補(bǔ)充！ 已有29人參與
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(1)我的SDS-PAGE 用了半年卻還能用。10%SDS溶液兩年了目前好著呢，他是結(jié)晶的用前熱水浴溶解即可，常溫保存。AP用一個(gè)月肯定沒有問題。TEMED好像用了10年了，沒有問題，不可思議。但快過期的甲叉試劑會(huì)使膠凝固時(shí)，梳子的齒處長(zhǎng)短不齊。 ________________________________________ (2)我們用的是Invitrogen的kit, 我做的不多，只做過GFP，也列下錯(cuò)誤： 1. 用錯(cuò)了running buffer,跑出來的帶呈彩虹弧形，而且跑得非常慢 2. 第一次抗體濃度過高（1/500），跑出來的帶看不出濃度差異，第二次一級(jí)抗體和耳機(jī)抗體的稀釋比率分別是（1/1000和1/4000），效果比較理想。 3.目前正在進(jìn)行中的是一次跑兩批蛋白(兩張膠），但是出來結(jié)果一張有一張白版，不知道是什么原因。。。 ________________________________________ (3)我也是剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，盡犯些不該犯得小卻致命的錯(cuò)誤，每次都懊惱得想撞墻，現(xiàn)得一結(jié)論，做實(shí)驗(yàn)一定到認(rèn)真，每次都把protocol重寫一邊，做到哪劃到哪，省得出錯(cuò)。 ________________________________________ (4)今天第一次灌膠 所用設(shè)備為BIO-RAD 為防止漏膠 先在下層小心鋪一層速凝膠 （可在加TEMED之前取0.5ml分離膠液于另一小器皿中 然后加入10微升TEMED 然后灌速凝膠）靜置3分鐘后按常規(guī)方法灌分離膠 濃縮膠，結(jié)果未見漏膠情況發(fā)生。另外本人在流水沖洗下拔梳子 結(jié)果未見梳孔歪斜情況發(fā)生。第一次灌膠即比較成功。 ________________________________________ (5)我的錯(cuò)誤才搞笑，剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)做膠， 分離膠的配方和濃縮都弄成一樣的了． 還和別人討論錯(cuò)誤在哪里？怎么總是在分離膠就有帶 狂暈ing～～ ________________________________________ (6)一次有個(gè)師弟過來告訴我,他的SDS-PAGE上不了樣 我有些奇怪,過去看究竟,果然,他把樣品加入點(diǎn)樣孔之后,樣品不是沉到底部,而是象蘭色煙霧一樣從孔內(nèi)飄起來,很快飄散干凈 感覺是樣品忽然變輕了,或者----電泳緩沖液變重了 后來發(fā)現(xiàn)原因是后者,原來他倒錯(cuò)了電泳緩沖液,把10倍的緩沖液倒進(jìn)了電泳槽,換回來就行了 ________________________________________ (7)我是新手正在做WB，我想請(qǐng)教各位高手一個(gè)問題，我跑了三次膠每次都跑成哭臉，我求助過一些高手，說可能是膠的底部有氣泡所致，我仔細(xì)看了我作的膠底部確實(shí)有許多氣泡，不論我怎么小心，有時(shí)在剛灌完分離膠時(shí)沒有明顯的氣泡，靜置一會(huì)后在膠的底部回出現(xiàn)許多小氣泡，這是什么原因呢？ 膠凝固后體積會(huì)縮小。你可以加少許緩沖液后把槽傾斜，將氣泡趕掉。 ________________________________________ (8)我所犯的錯(cuò)誤也不少。 沒加BUFFER就煮蛋白樣品，結(jié)果全沉淀了，樣品只能扔掉。 轉(zhuǎn)膜忘了冰浴。不過，作出來的結(jié)果沒有受到影響。 膜上面忘了標(biāo)記號(hào)，做完了不知道是什么樣品了。建議用鉛筆在MARKER的位置標(biāo)個(gè)記號(hào)。 膠冬天氣溫低時(shí)不容易凝固，可以將AP，TEMED加倍，放在37度里。 AP，TEMED，每次配1ml都是放四度，最長(zhǎng)可能用了2個(gè)月沒問題，SDS放在室溫，1年了，好像沒什么影響。 不要迷信進(jìn)口抗體，進(jìn)口抗體也會(huì)有時(shí)候做不出來。 ________________________________________ (9)我們也是加大AP濃度來加快凝膠速度的，不過有一次加大太多，凝得太快跑出來?xiàng)l帶有點(diǎn)歪歪扭扭的，不好看，建議30min左右聚合就可以了，太快也不好。 另外我們圖便宜，用了國(guó)產(chǎn)的槽。還不錯(cuò)，跟借來的Bio-rad差不多，不用封，也不漏膠，只是沒有那個(gè)塑料剝膠板，便宜啊！這樣已經(jīng)不錯(cuò)了！ ________________________________________ (10)我覺得防止記錯(cuò)加樣順序的方法可以是，MARKER兩邊加不同個(gè)數(shù)的樣本。如：MARKER左邊加了4個(gè)，右邊加了5個(gè)。脫色完了，一看就明白了。 我就是這樣干的，個(gè)人有點(diǎn)懶，就經(jīng)常用這個(gè)方法 ________________________________________ (11)前些日子做SDSPAGE，做了兩天，犯了一大堆錯(cuò)誤，寫出來供大家借鑒： 1 聽有人說瓊脂粉可以做封底膠，一試，漏了，還是用瓊脂糖吧。 2 AP用別人舊的，結(jié)果膠不干 3 A液，B液用舊的，不干。 結(jié)論：不要用別人的，一定要自已配，別怕浪費(fèi)。 4 前后Tris 的PH值搞錯(cuò)，結(jié)果不凝 5 電泳時(shí)長(zhǎng)板接負(fù)極，反了 6 剝膠時(shí)，忘了切角，自已都不記得哪是哪的。 再剝時(shí)，分離膠與積層膠分開了，又搞不清什么是什么了。(可以用注射器向膠與玻璃之間注水，就可以很完整的剝下來。) ________________________________________ (12)我們也是bio-rad的不用封底， 對(duì)于APS個(gè)人覺得每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該形成一種規(guī)則，就是所有配置的溶液都寫上日期和標(biāo)簽，并注明操作的人名，這樣是一種負(fù)責(zé)的態(tài)度，除了問題很溶液找到來源，另外日期可以很明白判斷是否過期，APS一般一個(gè)星期4度下， 浪費(fèi)也是可恥的，不要把實(shí)驗(yàn)室的東西不擋自己的。另外配置母液的時(shí)候最好用超純水，這樣配置的緩沖液放一年都沒有什么問題。 ________________________________________ (13)要想跑出好的膠，有條件的可以在最后加入APS或TEMED前，給混合的溶液脫脫氣，效果會(huì)好些。 列舉一些新人犯的錯(cuò)誤： 1 配膠時(shí)加錯(cuò)試劑； 2 電泳時(shí)未通電或未及時(shí)通電； 3 先上樣后加緩沖液； 4 正負(fù)極搞反； 5 緩沖液沒加夠，浸沒不了濃縮膠，電路不通； 6 樣品煮完沒離心；離心是為了去除不溶性顆粒，不然會(huì)影響電泳。 7 電泳時(shí)未用的上樣孔沒1X上樣緩沖； 8 電泳過程中漏液等 ________________________________________ (14)我也說一下自己遇到的問題 1.膠凝時(shí)放入37度溫箱，誰知溫度比設(shè)置的高了一兩度，膠凝后發(fā)現(xiàn)邊緣不平整，所以后來我一直將溫度調(diào)在34度，沒出過問題，呵呵 2.配好分離膠后，液面用異丙醇封閉，用槍加異丙醇時(shí)太猛了，使膠邊緣凝聚的不平整。所以以后加異丙醇時(shí)要輕輕的 。 [ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 16:32 ] |
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