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【資料】植物總蛋白提取方法
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一提取植物總蛋白（以植物花粉為例）： 1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉總蛋白質(zhì) 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白質(zhì)，-20度 2個小時(必要時過夜)，4度 25000g離心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液懸浮沉淀，-20度 1個小時,再次離心去上清，將真空干燥的沉淀在等電聚焦緩沖液中(8M urea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震蕩1小時，20度25000g離心20min，收集上清，沉淀再次用IEF緩沖液離心收集上清，可為后續(xù)試驗做準備。 2．苯酚（phenol）提取法 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris 8.8 緩沖液）繼續(xù)研磨5min,加提取緩沖液（0.1mol/L 8.8 Tr i s –HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。將樣本轉(zhuǎn)移至離心管中，4度 震蕩30min，25000g離心10min，將上層的phenol層轉(zhuǎn)移進另一個試管，將下邊的水相層加1ml的phenol（tris 8.8 緩沖液）及提取緩沖液，震蕩，離心，將再次收集到的phenol與前邊收集的混合，加5倍體積的0.1 M ammonium acetate in 100%methanol，在-20度震蕩沉淀蛋白質(zhì)，必要時過夜，4度 25000g離心10min，將沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗兩次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重懸— -20度震蕩30min，4度 25000g離心20min，洗劑完成后，沉淀真空干燥，IEF buffer提取蛋白質(zhì)，如方法1。 3．直接IEF buffer提取蛋白質(zhì) 直接IEF buffer提取蛋白質(zhì)，花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，然后加入IEF buffer(8M尿素，20mmDTT,4%CHAPS，5mmEDTA，5mmTris base,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。 4．Tris-HCL緩沖液法 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，加入Tris-HCL緩沖液（50mm,8.8,Tris-HCL, 5mmEDTA,20mmDTT,100mmKCL,2mmPMSF）,在融化后，混合液在4度放30min, 25000g離心20min,收集上清，對沉淀重新提取一次，將收集到的上清混合，用5倍體積的100%丙酮沉淀蛋白質(zhì)，-20度孵育2h,離心后，用80%的丙酮洗劑沉淀2次，IEF buffer重懸沉淀，方法如1 5．利用Bradford試劑法估測提取的總蛋白濃度，并調(diào)整濃度行蛋白電泳，-80度保存。 本人翻譯的，具體方法流程見附件原文。[ Last edited by xjtuwgz on 2011-9-28 at 17:24 ] · [ Last edited by silicare on 2012-11-6 at 07:52 ] |
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