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tangchaoxi

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[交流] 【求助】蛋白提取

請(qǐng)問(wèn)下酸會(huì)影響提細(xì)菌蛋白嗎？因?yàn)槲倚枰獙⑴囵B(yǎng)基中的難溶磷用酸溶掉才能得到菌體。謝謝。另外，提出的蛋白可以直接雙向電泳嗎？

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1樓 2011-04-12 11:18:00

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HarveyWang

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tangchaoxi(金幣+3): 2011-04-13 08:45:56

引用回帖:

Originally posted by tangchaoxi at 2011-04-12 11:18:00:
請(qǐng)問(wèn)下酸會(huì)影響提細(xì)菌蛋白嗎？因?yàn)槲倚枰獙⑴囵B(yǎng)基中的難溶磷用酸溶掉才能得到菌體。謝謝。另外，提出的蛋白可以直接雙向電泳嗎？

后面看到，你的蛋白是用來(lái)做雙向電泳的，而不是測(cè)活的。
因此，低pH的酸應(yīng)該影響不到蛋白吧。關(guān)鍵是你加酸量有多少？
難道要加100 mM的HCl處理一小時(shí)？
那菌體估計(jì)都要破掉了。

你的菌體的獲得很麻煩嗎？難道是生長(zhǎng)在磷酸鈣之類的上面？

菌體提取的蛋白，要分成幾類：
1）最簡(jiǎn)單的，可溶性上清中的蛋白: 去除鹽類后，可以做雙向電泳的樣品。

2）膜蛋白，因?yàn)榭扇苄圆�，需要特殊的試劑處理，增加其在第一維電泳時(shí)的可溶性。具體的你得去查論文，這里只是提示一下。

另外，實(shí)際上，對(duì)于全細(xì)胞蛋白，雙向電泳許多時(shí)候會(huì)過(guò)濾掉很多蛋白點(diǎn)的！
選擇雙向電泳Loading buffer 組分很關(guān)鍵。

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2樓2011-04-12 17:41:10

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tangchaoxi

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謝謝！培養(yǎng)基中是有磷酸鈣，我就是要加酸把它給溶了，時(shí)間不長(zhǎng)，溶了之后立即離心，用緩沖液洗洗可以嗎？我是想提蛋白，雙向電泳找差異蛋白。直接上雙向找可以嗎？

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3樓2011-04-13 08:50:37

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Originally posted by HarveyWang at 2011-04-12 17:41:10:
后面看到，你的蛋白是用來(lái)做雙向電泳的，而不是測(cè)活的。
因此，低pH的酸應(yīng)該影響不到蛋白吧。關(guān)鍵是你加酸量有多少？
難道要加100 mM的HCl處理一小時(shí)？
那菌體估計(jì)都要破掉了。

你的菌體的獲得很麻煩 ...

我直接用濃鹽酸溶，可以嗎

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4樓2011-04-13 09:00:21

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tangchaoxi(金幣+3): 2011-04-13 20:28:37

引用回帖:

Originally posted by tangchaoxi at 2011-04-13 09:00:21:
我直接用濃鹽酸溶，可以嗎

絕對(duì)不可以。
濃鹽酸會(huì)溶解細(xì)胞，1min 內(nèi)就溶解了，然后大部分蛋白被酸沉。
酸，即使50 mM HCl，也會(huì)沉淀許多細(xì)胞蛋白。

我覺(jué)得你沒(méi)必要非要這時(shí)候去除磷酸鈣。
你可以在破碎菌體時(shí)離心去除的。

你如果是做菌體上清蛋白，而發(fā)酵液沒(méi)有其他固體培養(yǎng)基的話，
建議你在pH8-10之間，直接超聲破碎  發(fā)酵液沉淀（就是磷酸鈣+菌體），
然后在4℃ 10000 rpm  離心10-20min,
這樣，磷酸鈣都沉淀了，  取上清即可。

如果想溶解更多的膜蛋白（或全菌體蛋白），需要用2D電泳的Loading Buffer 加入發(fā)酵液沉淀，來(lái)直接超聲破碎沉淀，然后在4℃ 10000 rpm  離心10-20min，取上清。

如果想鑒定破碎液的蛋白，就用SDS -PAGE電泳 loading buffer, 加入樣品后沸水浴3-5min，離心，上樣即可。

你看如何？

[ Last edited by HarveyWang on 2011-4-13 at 18:40 ]

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5樓2011-04-13 18:34:09

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Originally posted by HarveyWang at 2011-04-13 18:34:09:
絕對(duì)不可以。
濃鹽酸會(huì)溶解細(xì)胞，1min 內(nèi)就溶解了，然后大部分蛋白被酸沉。
酸，即使50 mM HCl，也會(huì)沉淀許多細(xì)胞蛋白。

我覺(jué)得你沒(méi)必要非要這時(shí)候去除磷酸鈣。
你可以在破碎菌體時(shí)離心去除 ...

不得不說(shuō)你真的很厲害，分析的很詳細(xì)！謝謝！現(xiàn)在問(wèn)題是我找差異蛋白應(yīng)該是提菌體蛋白，好像是將菌液離心，去上清，再用緩沖液重懸，然后直接硫酸銨沉淀蛋白，這過(guò)程中哪兒能去掉磷酸鈣呢？還有，我那個(gè)菌產(chǎn)酸，培養(yǎng)一天后pH值就已經(jīng)是3點(diǎn)幾了，是不是已經(jīng)不能提蛋白了？勞煩您再給說(shuō)說(shuō)，O(∩_∩)O謝謝

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6樓2011-04-13 20:47:54

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tangchaoxi(金幣+2): 2011-05-25 09:50:40

引用回帖:

Originally posted by tangchaoxi at 2011-04-13 20:47:54:
不得不說(shuō)你真的很厲害，分析的很詳細(xì)！謝謝！現(xiàn)在問(wèn)題是我找差異蛋白應(yīng)該是提菌體蛋白，好像是將菌液離心，去上清，再用緩沖液重懸，然后直接硫酸銨沉淀蛋白，這過(guò)程中哪兒能去掉磷酸鈣呢？還有，我那個(gè)菌產(chǎn)酸， ...

1)既然是找菌體差異蛋白，那應(yīng)該是全菌體蛋白。怎么是用硫酸銨來(lái)沉淀菌體蛋白呢？

全菌體蛋白的提取就是用 2D電泳的 Loading buffer （里面主要的是尿素或硫脲，還有些非離子表面活性劑等等。。這要看你的優(yōu)化條件）。

你分離出細(xì)胞就可以了。不需要硫酸銨沉淀蛋白，再說(shuō)硫酸銨沉淀蛋白不可能時(shí)完全的，對(duì)于你找群體差異蛋白造成很大干擾。

按照你的情況，發(fā)酵液離心得到磷酸鈣和菌體沉淀，然后用緩沖液重懸，再離心沉淀，然后就加蛋白提取液。（2D電泳膜蛋白提取好像也有試劑盒的，比較貴些。。。你也可以選擇最近的文獻(xiàn)中全細(xì)胞提取尤其是膜蛋白提取的配方）

2）菌體產(chǎn)酸對(duì)全菌體蛋白提取過(guò)程不會(huì)有什么影響。

因?yàn)槟阋l(fā)酵液離心（1 mL 發(fā)酵液足夠了），然后用4℃ 0.9% NaCl 洗滌一下，再離心，直接加全菌體蛋白提取液。

離心機(jī)最好選用高速的。例如 10000 rpm--30 sec 就基本可以離心下菌體細(xì)胞了。這個(gè)洗滌過(guò)程操作也就1-2min時(shí)間。

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7樓2011-04-14 07:34:12

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