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[交流]
【求助】蛋白提取
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| 請問下酸會影響提細(xì)菌蛋白嗎？因為我需要將培養(yǎng)基中的難溶磷用酸溶掉才能得到菌體。謝謝。另外，提出的蛋白可以直接雙向電泳嗎？ |
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3樓2011-04-13 08:50:37
★ ★
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵發(fā)帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金幣+3): 2011-04-13 08:45:56
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵發(fā)帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金幣+3): 2011-04-13 08:45:56
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后面看到，你的蛋白是用來做雙向電泳的，而不是測活的。 因此，低pH的酸應(yīng)該影響不到蛋白吧。 關(guān)鍵是你加酸量有多少？ 難道要加100 mM的HCl處理 一小時？ 那菌體估計都要破掉了。 你的菌體的獲得很麻煩嗎？難道是生長在磷酸鈣之類的上面？ 菌體提取的蛋白，要分成幾類： 1）最簡單的，可溶性上清中的蛋白: 去除鹽類后，可以做雙向電泳的樣品。 2）膜蛋白，因為可溶性差，需要特殊的試劑處理，增加其在第一維電泳時的可溶性。具體的你得去查論文，這里只是提示一下。 另外，實際上，對于全細(xì)胞蛋白，雙向電泳許多時候會過濾掉很多蛋白點的！ 選擇雙向電泳Loading buffer 組分很關(guān)鍵。 |
2樓2011-04-12 17:41:10
4樓2011-04-13 09:00:21
tangchaoxi(金幣+3): 2011-04-13 20:28:37
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絕對不可以。 濃鹽酸會溶解細(xì)胞，1min 內(nèi)就溶解了，然后大部分蛋白被酸沉。 酸，即使50 mM HCl，也會沉淀許多細(xì)胞蛋白。 我覺得你沒必要非要這時候去除磷酸鈣。 你可以在破碎菌體時離心去除的。 你如果是做菌體上清蛋白，而發(fā)酵液沒有其他固體培養(yǎng)基的話， 建議你在pH8-10之間，直接超聲破碎 發(fā)酵液沉淀（就是磷酸鈣+菌體）， 然后在4℃ 10000 rpm 離心10-20min, 這樣，磷酸鈣都沉淀了， 取上清即可。 如果想溶解更多的膜蛋白（或全菌體蛋白），需要用2D電泳的Loading Buffer 加入發(fā)酵液沉淀，來直接超聲破碎沉淀，然后在4℃ 10000 rpm 離心10-20min，取上清。 如果想鑒定破碎液的蛋白， 就用SDS -PAGE電泳 loading buffer, 加入樣品后沸水浴3-5min，離心，上樣即可。 你看如何？ [ Last edited by HarveyWang on 2011-4-13 at 18:40 ] |
5樓2011-04-13 18:34:09
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