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[交流]
【求助】蛋白提取
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| 請問下酸會影響提細菌蛋白嗎？因為我需要將培養(yǎng)基中的難溶磷用酸溶掉才能得到菌體。謝謝。另外，提出的蛋白可以直接雙向電泳嗎？ |
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amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵發(fā)帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金幣+3): 2011-04-13 08:45:56
amisking(金幣+2, EPI+1): 鼓勵發(fā)帖交流。 2011-04-12 21:45:46
tangchaoxi(金幣+3): 2011-04-13 08:45:56
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后面看到，你的蛋白是用來做雙向電泳的，而不是測活的。 因此，低pH的酸應該影響不到蛋白吧。 關鍵是你加酸量有多少？ 難道要加100 mM的HCl處理 一小時？ 那菌體估計都要破掉了。 你的菌體的獲得很麻煩嗎？難道是生長在磷酸鈣之類的上面？ 菌體提取的蛋白，要分成幾類： 1）最簡單的，可溶性上清中的蛋白: 去除鹽類后，可以做雙向電泳的樣品。 2）膜蛋白，因為可溶性差，需要特殊的試劑處理，增加其在第一維電泳時的可溶性。具體的你得去查論文，這里只是提示一下。 另外，實際上，對于全細胞蛋白，雙向電泳許多時候會過濾掉很多蛋白點的！ 選擇雙向電泳Loading buffer 組分很關鍵。 |
2樓2011-04-12 17:41:10
3樓2011-04-13 08:50:37
4樓2011-04-13 09:00:21
tangchaoxi(金幣+3): 2011-04-13 20:28:37
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絕對不可以。 濃鹽酸會溶解細胞，1min 內(nèi)就溶解了，然后大部分蛋白被酸沉。 酸，即使50 mM HCl，也會沉淀許多細胞蛋白。 我覺得你沒必要非要這時候去除磷酸鈣。 你可以在破碎菌體時離心去除的。 你如果是做菌體上清蛋白，而發(fā)酵液沒有其他固體培養(yǎng)基的話， 建議你在pH8-10之間，直接超聲破碎 發(fā)酵液沉淀（就是磷酸鈣+菌體）， 然后在4℃ 10000 rpm 離心10-20min, 這樣，磷酸鈣都沉淀了， 取上清即可。 如果想溶解更多的膜蛋白（或全菌體蛋白），需要用2D電泳的Loading Buffer 加入發(fā)酵液沉淀，來直接超聲破碎沉淀，然后在4℃ 10000 rpm 離心10-20min，取上清。 如果想鑒定破碎液的蛋白， 就用SDS -PAGE電泳 loading buffer, 加入樣品后沸水浴3-5min，離心，上樣即可。 你看如何？ [ Last edited by HarveyWang on 2011-4-13 at 18:40 ] |
5樓2011-04-13 18:34:09
6樓2011-04-13 20:47:54
tangchaoxi(金幣+2): 2011-05-25 09:50:40
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1)既然是找菌體差異蛋白，那應該是全菌體蛋白。 怎么是用硫酸銨來沉淀菌體蛋白呢？ 全菌體蛋白的提取就是用 2D電泳的 Loading buffer （里面主要的是尿素或硫脲，還有些非離子表面活性劑等等。。這要看你的優(yōu)化條件）。 你分離出細胞就可以了。不需要硫酸銨沉淀蛋白，再說硫酸銨沉淀蛋白不可能時完全的，對于你找群體差異蛋白造成很大干擾。 按照你的情況，發(fā)酵液離心得到磷酸鈣和菌體沉淀，然后用緩沖液重懸，再離心沉淀，然后就加蛋白提取液 。（2D電泳膜蛋白提取 好像也有試劑盒的，比較貴些。。。你也可以選擇最近的文獻中 全細胞提取 尤其是膜蛋白提取的配方） 2）菌體產(chǎn)酸 對全菌體蛋白提取過程不會有什么影響。 因為你要發(fā)酵液離心（1 mL 發(fā)酵液足夠了），然后用4℃ 0.9% NaCl 洗滌一下，再離心，直接加 全菌體蛋白提取液。 離心機最好選用高速的。例如 10000 rpm--30 sec 就基本可以離心下菌體細胞了。這個洗滌過程操作也就1-2min時間。 |
7樓2011-04-14 07:34:12
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