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平安銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
急求 G418篩選相關(guān)問題
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大家好 幫幫忙 我第一次做穩(wěn)轉(zhuǎn) hela細胞 現(xiàn)在首先要做G418 最佳濃度的預(yù)實驗問題如下： 我想知道24孔板 每個孔要接種多少細胞 還有就是什么時候加入梯度濃度的G418 進行篩選 謝謝各位了 |
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xinqing617
銅蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-10-24 11:48:57
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-10-24 11:48:57
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篩選之前 由于每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細胞稀釋到1000個細胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。 由于每種細胞對G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml～1000ug/ml范圍。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細胞對這一批G418的最佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細胞系G418的最佳用量還是穩(wěn)定的。《分子克隆》給出了幾個常用細胞系所需G418的最佳用量。 細胞系或機體 G418濃度（ug/ml） 中國倉鼠卵巢細胞 700～800 Madin-Darby犬腎細胞 500 人上皮A431細胞 400 猿CV-1細胞 500 盤基網(wǎng)柄菌屬 10～35 植物 10 酵母 125～500 看下面的一個試驗：3×106個細胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細胞到24孔板中，48 h后加藥篩選，此時1/300細胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個克隆，事實上，它們幾乎全死光了，只有幾個克隆。所以匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50%！ 加藥時間 由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，最終導致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。 培養(yǎng)液 加藥篩選約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現(xiàn)兩個問題：1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導致那些有neo表達的陽性細胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細胞，在3T3細胞匯合度達到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。 挑選單克隆的優(yōu)化 為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認，在陽性克隆下用記號筆做個標記。然后刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或則用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。 鑒定之后 一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機整合，會導致表達的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據(jù)優(yōu)勢，強表達目的蛋白的細胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經(jīng)過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細胞克隆。 |
2樓2011-10-23 10:29:28
3樓2011-10-23 15:00:10
平安
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4樓2011-10-23 16:36:20
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5樓2014-01-02 11:34:42
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