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平安銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
急求 G418篩選相關(guān)問題
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大家好 幫幫忙 我第一次做穩(wěn)轉(zhuǎn) hela細(xì)胞 現(xiàn)在首先要做G418 最佳濃度的預(yù)實(shí)驗(yàn)問題如下： 我想知道24孔板 每個(gè)孔要接種多少細(xì)胞 還有就是什么時(shí)候加入梯度濃度的G418 進(jìn)行篩選 謝謝各位了 |
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3樓2011-10-23 15:00:10
xinqing617
銅蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-10-24 11:48:57
silicare(金幣+1): 謝謝參與 2011-10-24 11:48:57
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篩選之前 由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個(gè)細(xì)胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10~14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。 由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，一般變動(dòng)在100ug/ml～1000ug/ml范圍。而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定你的細(xì)胞對(duì)這一批G418的最佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是穩(wěn)定的�！斗肿涌寺 方o出了幾個(gè)常用細(xì)胞系所需G418的最佳用量。 細(xì)胞系或機(jī)體 G418濃度（ug/ml） 中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞 700～800 Madin-Darby犬腎細(xì)胞 500 人上皮A431細(xì)胞 400 猿CV-1細(xì)胞 500 盤基網(wǎng)柄菌屬 10～35 植物 10 酵母 125～500 看下面的一個(gè)試驗(yàn)：3×106個(gè)細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000，1/1000，1/300細(xì)胞到24孔板中，48 h后加藥篩選，此時(shí)1/300細(xì)胞孔內(nèi)大約50%匯合度。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000孔內(nèi)有兩三個(gè)克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有幾十個(gè)克隆，事實(shí)上，它們幾乎全死光了，只有幾個(gè)克隆。所以匯合度對(duì)G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時(shí)匯合度不宜超過50%！ 加藥時(shí)間 由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。 培養(yǎng)液 加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無幾。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問題：1.死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。 挑選單克隆的優(yōu)化 為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以及增加陽性克隆的得率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號(hào)筆做個(gè)標(biāo)記。然后刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或則用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個(gè)新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。 鑒定之后 一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整合到基因組中的概率太小了，而且是隨機(jī)整合，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白的量產(chǎn)生很大差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達(dá)目的基因的細(xì)胞會(huì)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞會(huì)越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經(jīng)過2次以上的篩選之后才能找到那種我們想要的強(qiáng)分泌目的蛋白的，遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。 |
2樓2011-10-23 10:29:28
平安
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4樓2011-10-23 16:36:20
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5樓2014-01-02 11:34:42
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