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[求助]
關于重組質粒遺傳轉化中載體的問題
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請教各位：用于對質粒雙酶切的載體怎么選擇？ 最近做關于大豆一些特異表達基因篩選鑒定的實驗，是利用cDNA-AFLP方法找到所需的DNA條帶，再與**載體連接，并進行重組質粒遺傳轉化和陽性克隆鑒定。 其中這個**載體我不知道怎么選擇？ 是根據(jù)所需要的酶切位點來選擇嗎？如果是的話，那這個酶切位點又該如何選擇呢？ 剛開始接觸這一方面，不懂得太多，還望大家詳細告解，謝謝。 “參照常規(guī)方法，用 5μl 連接產(chǎn)物熱激轉化大腸桿菌感受態(tài) DH5α，鋪含有 50μg/mL氨芐青霉素的 LB 平板，37℃下培養(yǎng)后挑取單菌落。用含有 50μg/mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)單菌落，堿裂解法提取質粒。進一步用 pUCm-T 載體上含有的多克隆限制性切點 EcoRI 和 HindIII 對質粒進行雙酶切，鑒定陽性克隆。酶切反應 37℃下進行，時間為 2 h。酶切的反應體系如下表。同時，以質粒為模板，用選擇性擴增的特異引物對進行 PCR 的進一步檢測�！边@是我找到的一篇做法相似的文獻內容，我所不明白的就是里面那個pUCm-T載體他是如何選擇的。 |
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xiaoche
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- 專業(yè): 植物遺傳學
2樓2011-10-27 18:36:53
【答案】應助回帖
★ ★ ★
wfw014(金幣+3): 十分感謝，受教了 2011-10-27 23:04:20
jhu132llh(金幣+3): good,鼓勵積極應助 2011-10-28 08:35:57
wfw014(金幣+3): 十分感謝，受教了 2011-10-27 23:04:20
jhu132llh(金幣+3): good,鼓勵積極應助 2011-10-28 08:35:57
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看樣子你需要2個載體，第一個是克隆載體，第二個是轉化載體。 克隆載體比較好選，商品化的很多，像PMD-18T，pGEM-T easy載體，基本都可以，用于克隆測序，確定這個基因的序列與你想要一致。 酶切位點要選擇具有你的基因片段里沒有的，酶的酶切效率要盡量選擇高一些的，酶切后最好是粘末端。 轉化載體的選擇要和酶切位點的選擇結合起來，可以向你自己的導師或師兄師姐請教。 |
3樓2011-10-27 21:49:58
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