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wfw014銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于重組質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化中載體的問(wèn)題
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請(qǐng)教各位：用于對(duì)質(zhì)粒雙酶切的載體怎么選擇？ 最近做關(guān)于大豆一些特異表達(dá)基因篩選鑒定的實(shí)驗(yàn)，是利用cDNA-AFLP方法找到所需的DNA條帶，再與**載體連接，并進(jìn)行重組質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆鑒定。 其中這個(gè)**載體我不知道怎么選擇？ 是根據(jù)所需要的酶切位點(diǎn)來(lái)選擇嗎？如果是的話，那這個(gè)酶切位點(diǎn)又該如何選擇呢？ 剛開(kāi)始接觸這一方面，不懂得太多，還望大家詳細(xì)告解，謝謝。 “參照常規(guī)方法，用 5μl 連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài) DH5α，鋪含有 50μg/mL氨芐青霉素的 LB 平板，37℃下培養(yǎng)后挑取單菌落。用含有 50μg/mL 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)單菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒。進(jìn)一步用 pUCm-T 載體上含有的多克隆限制性切點(diǎn) EcoRI 和 HindIII 對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，鑒定陽(yáng)性克隆。酶切反應(yīng) 37℃下進(jìn)行，時(shí)間為 2 h。酶切的反應(yīng)體系如下表。同時(shí)，以質(zhì)粒為模板，用選擇性擴(kuò)增的特異引物對(duì)進(jìn)行 PCR 的進(jìn)一步檢測(cè)�！边@是我找到的一篇做法相似的文獻(xiàn)內(nèi)容，我所不明白的就是里面那個(gè)pUCm-T載體他是如何選擇的。 |
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xiaoche
銅蟲(chóng) (小有名氣)
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2樓2011-10-27 18:36:53
keyu762
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
wfw014(金幣+3): 十分感謝，受教了 2011-10-27 23:04:20
jhu132llh(金幣+3): good,鼓勵(lì)積極應(yīng)助 2011-10-28 08:35:57
wfw014(金幣+3): 十分感謝，受教了 2011-10-27 23:04:20
jhu132llh(金幣+3): good,鼓勵(lì)積極應(yīng)助 2011-10-28 08:35:57
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看樣子你需要2個(gè)載體，第一個(gè)是克隆載體，第二個(gè)是轉(zhuǎn)化載體。 克隆載體比較好選，商品化的很多，像PMD-18T，pGEM-T easy載體，基本都可以，用于克隆測(cè)序，確定這個(gè)基因的序列與你想要一致。 酶切位點(diǎn)要選擇具有你的基因片段里沒(méi)有的，酶的酶切效率要盡量選擇高一些的，酶切后最好是粘末端。 轉(zhuǎn)化載體的選擇要和酶切位點(diǎn)的選擇結(jié)合起來(lái)，可以向你自己的導(dǎo)師或師兄師姐請(qǐng)教。 |
3樓2011-10-27 21:49:58
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