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illcf_11銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
大腸桿菌基因重組時(shí)PKD46高溫怎么都消除不了
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小妹這些時(shí)間在做red基因重組技術(shù)，遇到pkd46質(zhì)粒在高溫下（42度甚至45度）還無法消除。具體步驟如下： 1、將PKD46化轉(zhuǎn)到W3110中，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，初步驗(yàn)證后，接種至AMP培養(yǎng)基中30度過夜培養(yǎng)，次日1：1000轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.2時(shí)加入，阿拉伯糖至終濃度100mM,繼續(xù)培養(yǎng)到OD0.6時(shí)，制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。 2、將打靶分子（pkd3來源，氯霉素抗性）200ng左右，1800V,4.1至4.3ms電轉(zhuǎn)至感受態(tài)中，37度培養(yǎng)2h后，涂布于氯霉素抗性的LB平板，37度過夜培養(yǎng)。 3、將氯霉素平板上長出的克隆，再次在氯霉素板上劃線，并PCR驗(yàn)證基因組是否敲除。陽性結(jié)果再制備化轉(zhuǎn)感受態(tài)，準(zhǔn)備將pcp20轉(zhuǎn)進(jìn)去，將氯霉素抗性消除。可是次日 平板上的克隆數(shù)巨多。 推測是在制備感受態(tài)的時(shí)候之前的pkd46沒有消除。于是將具有氯霉素抗性的單克隆接種至搖瓶，提高培養(yǎng)溫度至42甚至45度，企圖消除內(nèi)涵的pkd46，轉(zhuǎn)接數(shù)次，劃線amp平板，均生長狀態(tài)良好。如今我無法消除pkd46，嚴(yán)重影響后面轉(zhuǎn)化pcp20后，陽性克隆的挑選率。 哪位高手能指教一下……到底哪里出錯(cuò)，或是可以怎么解決 |
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4樓2011-10-27 16:13:09
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【答案】應(yīng)助回帖
illcf_11(金幣+10): 謝謝，目前已經(jīng)解決了，是我們的PKD46溫敏出了問題，換了新的質(zhì)粒就好了 2011-11-24 08:41:55
| 這幾個(gè)質(zhì)粒我以前用過，好像沒有樓主說的問題啊。在消除質(zhì)粒時(shí) ，培養(yǎng)液中不能加抗生素，然后在無抗性平板上劃線，然后驗(yàn)證對(duì)單菌落進(jìn)行氨芐敏感氯霉素抗性篩選（可以用傳統(tǒng)的牙簽點(diǎn)種法），同時(shí)要注意菌不要過多的接觸氯霉素，否則會(huì)出現(xiàn)即使氯霉素基因已經(jīng)消除菌仍有氯霉素抗性的情況。 |
5樓2011-10-28 15:05:51
602059625
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“陽性結(jié)果再制備化轉(zhuǎn)感受態(tài)，準(zhǔn)備將pcp20轉(zhuǎn)進(jìn)去，將氯霉素抗性消除�？墒谴稳� 平板上的克隆數(shù)巨多�！� pcp20轉(zhuǎn)進(jìn)去之后涂什么抗生素的平板？ 這是想篩已經(jīng)轉(zhuǎn)進(jìn)pcp20的菌嗎 pcp20上有amp、kan、cm三種抗性基因，如果擔(dān)心pKD46還沒有消除，可以涂cm平板來篩已經(jīng)轉(zhuǎn)進(jìn)pcp20的菌 消除基因組上的cm時(shí)應(yīng)該是在無抗生素的LB中培養(yǎng)吧 -------------------------------------------------------------------------------------------- 其實(shí)我也是做了幾次還沒成功 |
6樓2011-10-28 21:51:21
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