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changer32捐助貴賓 (小有名氣)
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[交流]
TCA/丙酮法提取植物蛋白 已有6人參與
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我用TCA/丙酮法提取植物蛋白，得到的蛋白在緩沖液中溶解性很差，呈膠質(zhì)狀，請問高手，這樣的現(xiàn)象正常嗎？ 另外更糟糕的是提到的蛋白做SDS-PAGE跑不出條帶，想請教問題出在哪里？針對我的實驗材料，TCA/丙酮法可行嗎？ |
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qiugaoxiang
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2樓2011-10-28 10:44:10
wangjetby
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3樓2011-10-28 11:25:08
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jhu132llh(金幣+2): 鼓勵交流 2011-10-28 17:08:59
jhu132llh(金幣+2): 鼓勵交流 2011-10-28 17:08:59
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提取步驟參照文獻 biotechnol.&biotechnol.EQ.24/2010/4 10g葉片，液氮磨成細粉，加20ml預冷的10%TCA-丙酮，充分混勻，-20℃放90min,4℃、11000rpm(約12000g)離心15min, 棄上清。 沉淀用20ml冷丙酮洗2次。 將沉淀在室溫空氣中晾干。 晾干后的沉淀加 6ml TLB緩沖液（8M Urea, 2M thiourea, 4%(w/v)CHAP, 0.4%(v/v)carrier ampho, 50mM DTT），充分混勻后保持5min. 提取物離心(11000rpm,15min,4℃),取上清液。 上清液加入4倍含10%（v/v)TCA的冷丙酮（其中含20mMDTT），在-20℃保持90min，混合物離心(11000rpm,15min,4℃),取沉淀。 沉淀用含20mMDTT的冷丙酮洗滌2次，沉淀風干后加TLB緩沖液溶解，得蛋白。 ----------------------------------------------------------------------------------- 得到的蛋白在TLB緩沖液中溶解性很差，SDS-PAGE也跑不出條帶。 ---------------------------------------------------------------- 文獻中的離心條件是16000g, 但我的離心機只能達到12000g。是不是離心力不夠呢？ -------------------------------------------------- 多謝高手指點！ |
4樓2011-10-28 12:38:00
guxinhan123
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5樓2011-10-28 17:03:20
guxinhan123
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6樓2011-10-28 17:03:59
changer32
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7樓2011-10-28 21:51:07
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
jhu132llh(金幣+3, APEPI+1): good,感謝積極應(yīng)助,很專業(yè) 2011-10-30 18:15:46
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
jhu132llh(金幣+3, APEPI+1): good,感謝積極應(yīng)助,很專業(yè) 2011-10-30 18:15:46
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看看這個nature protocol Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues 我前幾個星期，剛用這個protocol作的，還可以，你是要做2-D 吧。 主要是丙酮揮干這一步，不要太干，太干很難。 用超聲可能能幫助溶解 步驟是這樣的，和你的差不多，但少幾步： （1）Place frozen plant tissue into the cold mortar. Add acid-washed sand (0.5–5 g per 1 g fresh tissue; optional) and PVPP (1–15% (wt/wt); optional) and grind tissue into a fine powder using the pestle and mortar （2）Suspend the powder in TCA extraction buffer (5-15 ml solution per gram tissue). Store at –20 1C overnight. Proteins should precipitate as white flakes （3）Centrifuge the sample for 30 min at 5,000g at 4 1C. Carefully pipette out the supernatant and discard. （4）Add 10 ml ice-cold acetone to the pellet and centrifuge the sample for 10 min at 5,000g at 4 1C. Carefully remove the supernatant with a pipette and discard. （5）Repeat Step （4）two more times （6）Resuspend the pellet in a buffer for protein resuspension that is appropriate for the downstream analytical approach. Notes： Protein resolubilization is often one of the most challenging steps of the procedure. It may be necessary to increase the amount of buffer added to resuspend the pellet fully, and in some cases there may always be a residual pellet. Pellets can be resuspended in a microcentrifuge tube with a mini-magnetic stirrer. Sonication can also be used to help resuspend the pellet, but care should be taken not to heat the sample, so it is recommended that the sample be sonicated in short bursts while dipping the tube in ice water. |
8樓2011-10-30 00:15:04
changer32
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9樓2011-10-31 16:00:10
10樓2012-06-29 08:18:33
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