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H-xiangzhu金蟲 (正式寫手)
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微生物胞內(nèi)物質(zhì)與胞外代謝產(chǎn)物提取
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我要提取微生物胞內(nèi)和胞外代謝產(chǎn)物，要去除雜蛋白質(zhì)和菌體等，離心沉淀后， 1、上清液我加入草酸沉淀，后面加入丙酮溶解后離心去沉淀，請問丙酮我怎么去除呢？ 2、對于胞內(nèi)蛋白，我加入無水乙醇超聲波破碎，后面離心去除沉淀，可是我的上清液中有無水乙醇，請問用什么方法可以把無水乙醇去除呢？ 補充：1、我試驗樣品很少，就只有小幾ml這樣 2、我們實驗室只有真空泵，沒有旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和吹氮儀 |
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zhang8826857(金幣+1): 鼓勵交流 2011-11-14 09:21:22
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原來這樣啊。先看有沒有，根本不用向代謝組學(xué)一樣麻煩。 步驟如下： 1.測定胞外的活性物質(zhì)： 用滅菌的EP管，無菌取樣，然后10000rpm 離心5min，什么放線菌或細菌都會沉下去，然后用無菌的1% NaCl稀釋發(fā)酵離心上清液一系列濃度。然后做抑菌圈實驗。 2.胞內(nèi)的活性物質(zhì)： 由于不能確定是溶于有機溶劑的還是水溶性的。故拿細胞破碎液來做。 取菌絲沉淀，用無菌的1% NaCl清洗兩遍，以洗掉發(fā)酵液。 離心沉淀菌絲體，然后用1% NaCl超聲破碎，此時菌絲體越濃越好。 破碎液分為兩份： A份用1% NaCl稀釋一下，然后10000rpm 離心20min，上清液用無菌的NaCl稀釋一系列梯度，做抑菌圈實驗。 B份用有機溶劑，例如無水乙醇或丙酮等萃取，然后蒸干或風(fēng)干（步驟見前面我說的）。最好用丙酮來做，丙酮容易蒸掉。最后的干燥物用滅菌的1% NaCl稀釋一下，做抑菌圈實驗。 3.抑菌圈實驗： 在平板上涂目的細菌，例如八疊球菌或葡萄球菌等。 用那種滅菌的不銹鋼筒（內(nèi)徑大約為4mm，高度大約為1cm，沒有底）扣在此平板上。 每個平板可以扣4-8個。 然后向圈內(nèi)加20uL或50uL的上面的抑菌物質(zhì)稀釋液。 用卡那霉素或青霉素做陽性對照。 |
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H-xiangzhu13樓2011-11-11 19:00:37
2樓2011-11-07 13:02:19
H-xiangzhu
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3樓2011-11-07 13:56:38
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zhang8826857(金幣+3): good，看lz的反饋，lz反饋好可以向版主申請個EPI啊^_^ 2011-11-07 14:14:07
H-xiangzhu(金幣+1): 2011-11-07 15:23:40
zhang8826857(金幣+3): good，看lz的反饋，lz反饋好可以向版主申請個EPI啊^_^ 2011-11-07 14:14:07
H-xiangzhu(金幣+1): 2011-11-07 15:23:40
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1.我一般就是放在通風(fēng)櫥幾個小時，丙酮很快就揮發(fā)完了。剩余的主要是水分溶液。 乙醇的較難揮發(fā)，幾個小時后放在40攝氏度的抽真空的恒溫箱中，大約一個小時可以抽完剩余水分。 2.注意事項！ 這時候要注意，你到底是測什么？��！ 例如你要是測定發(fā)酵液的乙酸，肯定是要再抽之前加6M NaOH少許，將溶液變堿。因為在酸性條件下，乙酸在最后快抽干的時候要揮發(fā)的! 3.無論是丙酮還是乙醇，除蛋白的效果走不足以立即上液相柱子。其中會有不少的蛋白殘留。即使是使用80%以上的乙醇。不信，你可以拿BSA蛋白做下測試，看看跟三氯乙酸相比，能不能有多少蛋白沉淀。 但是，這一步中有一個很好的去處蛋白的方法。就是最后的干燥抽真空步驟。當(dāng)接近干燥的時候，所有的細胞蛋白都回變性沉淀的！ 就是說，對于干燥抽干的樣品，你只要用水溶液溶解，然后10000 rpm離心5-10分鐘，上清中就幾乎沒有蛋白了。 細胞蛋白都回變成一團沉在管子的底部。上清你可以直接上樣過柱子。 |
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4樓2011-11-07 14:10:46
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhang8826857(金幣+2): 鼓勵應(yīng)助 2011-11-11 11:29:53
zhang8826857(金幣+2): 鼓勵應(yīng)助 2011-11-11 11:29:53
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樓主MM，還有其他的幾個小技巧，哥都一塊兒告訴你。 1.樣品幾毫升足夠啦。用那種 5mL的EP管，將丙酮或乙醇用抽風(fēng)機抽去還剩下大約 1ml的時候，里面主要的就是水分啦，再難風(fēng)干啦。。。這時就換成抽真空恒溫箱。 恒溫箱可以開到40-50攝氏度，對于小分子的代謝物一般不會變質(zhì)的。 2.在抽真空的時候，一定要將EP管的蓋子完全打開，然后慢慢抽，因為可能會出現(xiàn)爆沸，將你的樣品都沖出來。所以這時候你要自己摸索一下抽的條件哈~~ |
5樓2011-11-07 14:19:23
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7樓2011-11-07 15:25:07
| 樓上的夠詳細�；貥侵�，如果干了，溶劑應(yīng)該都去掉了。如果樣品來得容易，可以拿些60-80°C烘干，看看恒重的跟干燥器的差別。也可以測分光光度曲線，用溶劑做對照，大致比較。 |
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8樓2011-11-07 15:40:51
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好的~~謝謝你哈 我去實驗下 9樓2011-11-07 15:45:07
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10樓2011-11-10 14:56:44
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