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H-xiangzhu金蟲 (正式寫手)
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[求助]
微生物胞內物質與胞外代謝產物提取
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我要提取微生物胞內和胞外代謝產物，要去除雜蛋白質和菌體等，離心沉淀后， 1、上清液我加入草酸沉淀，后面加入丙酮溶解后離心去沉淀，請問丙酮我怎么去除呢？ 2、對于胞內蛋白，我加入無水乙醇超聲波破碎，后面離心去除沉淀，可是我的上清液中有無水乙醇，請問用什么方法可以把無水乙醇去除呢？ 補充：1、我試驗樣品很少，就只有小幾ml這樣 2、我們實驗室只有真空泵，沒有旋轉蒸發(fā)儀和吹氮儀 |
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zhang8826857(金幣+1): 鼓勵交流 2011-11-14 09:21:22
zhang8826857(金幣+1): 鼓勵交流 2011-11-14 09:21:22
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原來這樣啊。先看有沒有，根本不用向代謝組學一樣麻煩。 步驟如下： 1.測定胞外的活性物質： 用滅菌的EP管，無菌取樣，然后10000rpm 離心5min，什么放線菌或細菌都會沉下去，然后用無菌的1% NaCl稀釋發(fā)酵離心上清液一系列濃度。然后做抑菌圈實驗。 2.胞內的活性物質： 由于不能確定是溶于有機溶劑的還是水溶性的。故拿細胞破碎液來做。 取菌絲沉淀，用無菌的1% NaCl清洗兩遍，以洗掉發(fā)酵液。 離心沉淀菌絲體，然后用1% NaCl超聲破碎，此時菌絲體越濃越好。 破碎液分為兩份： A份用1% NaCl稀釋一下，然后10000rpm 離心20min，上清液用無菌的NaCl稀釋一系列梯度，做抑菌圈實驗。 B份用有機溶劑，例如無水乙醇或丙酮等萃取，然后蒸干或風干（步驟見前面我說的）。最好用丙酮來做，丙酮容易蒸掉。最后的干燥物用滅菌的1% NaCl稀釋一下，做抑菌圈實驗。 3.抑菌圈實驗： 在平板上涂目的細菌，例如八疊球菌或葡萄球菌等。 用那種滅菌的不銹鋼筒（內徑大約為4mm，高度大約為1cm，沒有底）扣在此平板上。 每個平板可以扣4-8個。 然后向圈內加20uL或50uL的上面的抑菌物質稀釋液。 用卡那霉素或青霉素做陽性對照。 |
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H-xiangzhu13樓2011-11-11 19:00:37
2樓2011-11-07 13:02:19
H-xiangzhu
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【答案】應助回帖
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zhang8826857(金幣+3): good，看lz的反饋，lz反饋好可以向版主申請個EPI啊^_^ 2011-11-07 14:14:07
H-xiangzhu(金幣+1): 2011-11-07 15:23:40
zhang8826857(金幣+3): good，看lz的反饋，lz反饋好可以向版主申請個EPI啊^_^ 2011-11-07 14:14:07
H-xiangzhu(金幣+1): 2011-11-07 15:23:40
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1.我一般就是放在通風櫥幾個小時，丙酮很快就揮發(fā)完了。剩余的主要是水分溶液。 乙醇的較難揮發(fā)，幾個小時后放在40攝氏度的抽真空的恒溫箱中，大約一個小時可以抽完剩余水分。 2.注意事項！ 這時候要注意，你到底是測什么？�。� 例如你要是測定發(fā)酵液的乙酸，肯定是要再抽之前加6M NaOH少許，將溶液變堿。因為在酸性條件下，乙酸在最后快抽干的時候要揮發(fā)的! 3.無論是丙酮還是乙醇，除蛋白的效果走不足以立即上液相柱子。其中會有不少的蛋白殘留。即使是使用80%以上的乙醇。不信，你可以拿BSA蛋白做下測試，看看跟三氯乙酸相比，能不能有多少蛋白沉淀。 但是，這一步中有一個很好的去處蛋白的方法。就是最后的干燥抽真空步驟。當接近干燥的時候，所有的細胞蛋白都回變性沉淀的！ 就是說，對于干燥抽干的樣品，你只要用水溶液溶解，然后10000 rpm離心5-10分鐘，上清中就幾乎沒有蛋白了。 細胞蛋白都回變成一團沉在管子的底部。上清你可以直接上樣過柱子。 |
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4樓2011-11-07 14:10:46
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5樓2011-11-07 14:19:23
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6樓2011-11-07 14:22:56
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7樓2011-11-07 15:25:07
| 樓上的夠詳細。回樓主，如果干了，溶劑應該都去掉了。如果樣品來得容易，可以拿些60-80°C烘干，看看恒重的跟干燥器的差別。也可以測分光光度曲線，用溶劑做對照，大致比較。 |
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8樓2011-11-07 15:40:51
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好的~~謝謝你哈 我去實驗下 9樓2011-11-07 15:45:07
H-xiangzhu
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