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tco_001新蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于Q-PCR的一些疑問
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最近在做Q-pcr，要擴增一個表達量很底的mRNA 設(shè)計了引物上機去做，溶解曲線不單一有兩個峰，一個大一點一個小一點，大一點的應(yīng)該是產(chǎn)物，但兩峰高度差距不算太大，距離倒是蠻遠的 擴增曲線測定的Ct值在32左右，由于樣品的原因，提取的RNA可能不是很純，RNA濃度也不好提高了 改變過退火溫度，變化不大 換過很多引物，由于這個mRNA豐度太低，很多的引物都擴不出來 儀器自動分析的CT值在復(fù)孔之間差距0.5以內(nèi) 想問一下，我這個數(shù)據(jù)可以用么，如果不行要怎樣提高擴增的特異性或者怎樣改變一下？ |
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apple6299
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
silicare(金幣+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29
silicare(金幣+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29
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做Q-PCR數(shù)據(jù)好壞與否，首先是引物的設(shè)計合不合理，最好是找序列的保守區(qū)域進行擴增較好，如果自己設(shè)計不好，可以請教別人，如果是TaqMan探針的設(shè)計，目前是有公司幫設(shè)計的，價格貴蠻多的，看自己實驗室的情況了。其次還得保證模板RNA的純度，花多點時間在這，后面的實驗就會比較順利。實驗條件的摸索也比較重要，如果樣品多的話，最好做個標(biāo)準(zhǔn)曲線。SYBR Green法的影響因素較多，但是溶解曲線Tm值有兩個峰的數(shù)據(jù)肯定是不可以用的（這和引物的關(guān)系比較大，足以說明你的引物肯定不是很好，換引物試試吧），聽你描述的情況，離得蠻遠，高度差距不算太大，跑跑電泳看下，是不是引物二聚體，或者擴增了什么其他的東西。最后建議，SYBR Green法進行QPCR后，還是要跑下電泳比較好（反正也不花很多的時間，做塊膠，上個樣，就可以去干自己的事情了）。Ct值在32左右，如果對應(yīng)的Tm值在80-90攝氏度范圍內(nèi)（miRAN的擴增得看試劑盒的要求，好像是70-80攝氏度），且峰是尖銳單一的，這個值還是可以用的。好的數(shù)據(jù)是確保Ct值在25-30，這也就是為啥要做標(biāo)準(zhǔn)曲線的原因。 我做了兩年多的QPCR（SYBR以及TaqMan的都做過），這只是我小小的一點建議哈。僅供參考 |
8樓2011-11-16 17:13:10
terry130
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3樓2011-11-15 16:35:41
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4樓2011-11-15 18:47:58
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