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tco_001

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[求助] 關于Q-PCR的一些疑問

最近在做Q-pcr，要擴增一個表達量很底的mRNA
設計了引物上機去做，溶解曲線不單一有兩個峰，一個大一點一個小一點，大一點的應該是產(chǎn)物，但兩峰高度差距不算太大，距離倒是蠻遠的
擴增曲線測定的Ct值在32左右，由于樣品的原因，提取的RNA可能不是很純，RNA濃度也不好提高了
改變過退火溫度，變化不大
換過很多引物，由于這個mRNA豐度太低，很多的引物都擴不出來
儀器自動分析的CT值在復孔之間差距0.5以內
想問一下，我這個數(shù)據(jù)可以用么，如果不行要怎樣提高擴增的特異性或者怎樣改變一下？

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1樓 2011-11-14 21:25:42

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terry130

木蟲 (正式寫手)

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【答案】應助回帖

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silicare(金幣+3, BioEPI+1): 2011-11-15 17:53:01
tco_001(金幣+10): 2011-11-16 16:38:38

應該是有第二擴增造成的溶解曲線分離。這樣的數(shù)據(jù)不能用的。你必須得換引物，知道找到合適的位置。。你做的基因組有沒有全序列信息？如果有的話應該不難找到一對專一的引物。

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2樓2011-11-15 08:08:30

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tco_001

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2樓: Originally posted by terry130 at 2011-11-15 08:08:30:
應該是有第二擴增造成的溶解曲線分離。這樣的數(shù)據(jù)不能用的。你必須得換引物，知道找到合適的位置。。你做的基因組有沒有全序列信息？如果有的話應該不難找到一對專一的引物。

那是不是只要我的溶解曲線的峰時單一的就可以認為我的數(shù)據(jù)是可用的呢？
不知道在哪里看到說ct值超過30得出的結果就不是很可行了，畢竟qpcr的影響因素太多了

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3樓2011-11-15 16:35:41

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terry130

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【答案】應助回帖

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3樓: Originally posted by tco_001 at 2011-11-15 16:35:41:
那是不是只要我的溶解曲線的峰時單一的就可以認為我的數(shù)據(jù)是可用的呢？
不知道在哪里看到說ct值超過30得出的結果就不是很可行了，畢竟qpcr的影響因素太多了

你要理解溶解曲線的含義啊。他是cycle-signal曲線的導數(shù)曲線。一個標準的cycle-signal所對應的溶解曲線就應該是單峰的。這個只是數(shù)據(jù)可用的必要條件。并不是充分條件。如果你的非特異擴增曲線跟你的特異擴增曲線很相近的話，那么他們的溶解曲線仍然是單峰，但這種情況下的數(shù)據(jù)也是不可用的。這也是taqman探針法的優(yōu)勢所在了。~

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4樓2011-11-15 18:47:58

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tco_001

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4樓: Originally posted by terry130 at 2011-11-15 18:47:58:
你要理解溶解曲線的含義啊。他是cycle-signal曲線的導數(shù)曲線。一個標準的cycle-signal所對應的溶解曲線就應該是單峰的。這個只是數(shù)據(jù)可用的必要條件。并不是充分條件。如果你的非特異擴增曲線跟你的特異擴增曲線 ...

恩，現(xiàn)在我用的是SYBR green，那我如何檢查我擴增出來的產(chǎn)物是正確的而不是假陽性的結果呢？瓊脂糖電泳試過了，效果不是很好，做northern？還是不用檢測？

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5樓2011-11-15 21:29:55

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terry130

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【答案】應助回帖

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5樓: Originally posted by tco_001 at 2011-11-15 21:29:55:
恩，現(xiàn)在我用的是SYBR green，那我如何檢查我擴增出來的產(chǎn)物是正確的而不是假陽性的結果呢？瓊脂糖電泳試過了，效果不是很好，做northern？還是不用檢測？

你做real time PCR摸條件的時候都不跑電泳的嗎？？在確定條件之后要跑一下電泳哦。這是最基本的驗證了，必須是背景低，無拖帶，條帶單一才行。這個是sybr green法的要求~

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6樓2011-11-16 08:49:50

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tco_001

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6樓: Originally posted by terry130 at 2011-11-16 08:49:50:
你做real time PCR摸條件的時候都不跑電泳的嗎？？在確定條件之后要跑一下電泳哦。這是最基本的驗證了，必須是背景低，無拖帶，條帶單一才行。這個是sybr green法的要求~

好吧，主要是沒人帶就自己在那摸索著做，以前也用電泳摸過的，但是覺得reaLtime的條件和普通pcr的條件不是很一樣，照搬的話效果不是很好，但是一調整又覺得不確定了，很矛盾的

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7樓2011-11-16 16:38:30

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apple6299

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silicare(金幣+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29

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1樓: Originally posted by tco_001 at 2011-11-14 21:25:42:
最近在做Q-pcr，要擴增一個表達量很底的mRNA
設計了引物上機去做，溶解曲線不單一有兩個峰，一個大一點一個小一點，大一點的應該是產(chǎn)物，但兩峰高度差距不算太大，距離倒是蠻遠的
擴增曲線測定的Ct值在32左右， ...

做Q-PCR數(shù)據(jù)好壞與否，首先是引物的設計合不合理，最好是找序列的保守區(qū)域進行擴增較好，如果自己設計不好，可以請教別人，如果是TaqMan探針的設計，目前是有公司幫設計的，價格貴蠻多的，看自己實驗室的情況了。其次還得保證模板RNA的純度，花多點時間在這，后面的實驗就會比較順利。實驗條件的摸索也比較重要，如果樣品多的話，最好做個標準曲線。SYBR Green法的影響因素較多，但是溶解曲線Tm值有兩個峰的數(shù)據(jù)肯定是不可以用的（這和引物的關系比較大，足以說明你的引物肯定不是很好，換引物試試吧），聽你描述的情況，離得蠻遠，高度差距不算太大，跑跑電泳看下，是不是引物二聚體，或者擴增了什么其他的東西。最后建議，SYBR Green法進行QPCR后，還是要跑下電泳比較好（反正也不花很多的時間，做塊膠，上個樣，就可以去干自己的事情了）。Ct值在32左右，如果對應的Tm值在80-90攝氏度范圍內（miRAN的擴增得看試劑盒的要求，好像是70-80攝氏度），且峰是尖銳單一的，這個值還是可以用的。好的數(shù)據(jù)是確保Ct值在25-30，這也就是為啥要做標準曲線的原因。
我做了兩年多的QPCR（SYBR以及TaqMan的都做過），這只是我小小的一點建議哈。僅供參考

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8樓2011-11-16 17:13:10

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7樓: Originally posted by tco_001 at 2011-11-16 16:38:30:
好吧，主要是沒人帶就自己在那摸索著做，以前也用電泳摸過的，但是覺得reaLtime的條件和普通pcr的條件不是很一樣，照搬的話效果不是很好，但是一調整又覺得不確定了，很矛盾的

不是讓你用兩臺機器啊，是用同一臺機器做。只要是同一臺機器，條件就是通用的

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9樓2011-11-16 21:34:04

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8樓: Originally posted by apple6299 at 2011-11-16 17:13:10:
做Q-PCR數(shù)據(jù)好壞與否，首先是引物的設計合不合理，最好是找序列的保守區(qū)域進行擴增較好，如果自己設計不好，可以請教別人，如果是TaqMan探針的設計，目前是有公司幫設計的，價格貴蠻多的，看自己實驗室的情況了。 ...

謝謝你啊，主要我現(xiàn)在要做的是一個基因的亞型，這個基因轉錄后的pro-mRNA要經(jīng)過剪切過程形成7種mRNA亞型，每種之間區(qū)別就100bp左右，我其他的幾個都做得差不多了，就是有一個亞型死活做不好，這個亞型的引物我是直接用的人家文獻上面的，條件也是一樣的，但是做出來就是上面的結果。我的RNA確實不是很好，因為提取RNA的時候就做的不是很好，那我現(xiàn)在應該怎么辦呢？我都換了3-4種引物了，每對引物blast的時候都可以，但就是做的時候感覺不好，怨念

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10樓2011-11-16 22:15:44

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