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tco_001新蟲 (小有名氣)
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關(guān)于Q-PCR的一些疑問
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最近在做Q-pcr，要擴(kuò)增一個(gè)表達(dá)量很底的mRNA 設(shè)計(jì)了引物上機(jī)去做，溶解曲線不單一有兩個(gè)峰，一個(gè)大一點(diǎn)一個(gè)小一點(diǎn)，大一點(diǎn)的應(yīng)該是產(chǎn)物，但兩峰高度差距不算太大，距離倒是蠻遠(yuǎn)的 擴(kuò)增曲線測(cè)定的Ct值在32左右，由于樣品的原因，提取的RNA可能不是很純，RNA濃度也不好提高了 改變過退火溫度，變化不大 換過很多引物，由于這個(gè)mRNA豐度太低，很多的引物都擴(kuò)不出來(lái) 儀器自動(dòng)分析的CT值在復(fù)孔之間差距0.5以內(nèi) 想問一下，我這個(gè)數(shù)據(jù)可以用么，如果不行要怎樣提高擴(kuò)增的特異性或者怎樣改變一下？ |
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4樓2011-11-15 18:47:58
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5樓2011-11-15 21:29:55
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6樓2011-11-16 08:49:50
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7樓2011-11-16 16:38:30
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【答案】應(yīng)助回帖
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silicare(金幣+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29
silicare(金幣+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29
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做Q-PCR數(shù)據(jù)好壞與否，首先是引物的設(shè)計(jì)合不合理，最好是找序列的保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增較好，如果自己設(shè)計(jì)不好，可以請(qǐng)教別人，如果是TaqMan探針的設(shè)計(jì)，目前是有公司幫設(shè)計(jì)的，價(jià)格貴蠻多的，看自己實(shí)驗(yàn)室的情況了。其次還得保證模板RNA的純度，花多點(diǎn)時(shí)間在這，后面的實(shí)驗(yàn)就會(huì)比較順利。實(shí)驗(yàn)條件的摸索也比較重要，如果樣品多的話，最好做個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。SYBR Green法的影響因素較多，但是溶解曲線Tm值有兩個(gè)峰的數(shù)據(jù)肯定是不可以用的（這和引物的關(guān)系比較大，足以說明你的引物肯定不是很好，換引物試試吧），聽你描述的情況，離得蠻遠(yuǎn)，高度差距不算太大，跑跑電泳看下，是不是引物二聚體，或者擴(kuò)增了什么其他的東西。最后建議，SYBR Green法進(jìn)行QPCR后，還是要跑下電泳比較好（反正也不花很多的時(shí)間，做塊膠，上個(gè)樣，就可以去干自己的事情了）。Ct值在32左右，如果對(duì)應(yīng)的Tm值在80-90攝氏度范圍內(nèi)（miRAN的擴(kuò)增得看試劑盒的要求，好像是70-80攝氏度），且峰是尖銳單一的，這個(gè)值還是可以用的。好的數(shù)據(jù)是確保Ct值在25-30，這也就是為啥要做標(biāo)準(zhǔn)曲線的原因。 我做了兩年多的QPCR（SYBR以及TaqMan的都做過），這只是我小小的一點(diǎn)建議哈。僅供參考 |
8樓2011-11-16 17:13:10
terry130
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謝謝你啊，主要我現(xiàn)在要做的是一個(gè)基因的亞型，這個(gè)基因轉(zhuǎn)錄后的pro-mRNA要經(jīng)過剪切過程形成7種mRNA亞型，每種之間區(qū)別就100bp左右，我其他的幾個(gè)都做得差不多了，就是有一個(gè)亞型死活做不好，這個(gè)亞型的引物我是直接用的人家文獻(xiàn)上面的，條件也是一樣的，但是做出來(lái)就是上面的結(jié)果。我的RNA確實(shí)不是很好，因?yàn)樘崛NA的時(shí)候就做的不是很好，那我現(xiàn)在應(yīng)該怎么辦呢？我都換了3-4種引物了，每對(duì)引物blast的時(shí)候都可以，但就是做的時(shí)候感覺不好，怨念 |
10樓2011-11-16 22:15:44
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