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shuifen1108金蟲 (正式寫手)
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[求助]
連接轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21
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| 做完P(guān)CR，從T載體提取質(zhì)粒，酶切連接pet載體，轉(zhuǎn)化BL21，涂AMP板子是能夠生長的，但是提取質(zhì)粒酶切就是鑒定不出來，為什么呢？如果不是轉(zhuǎn)化成功了，在amp平板上應(yīng)該是不能生長的吧，可能是哪些原因?qū)е碌慕Y(jié)果，請指教 |
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gaojuan1985
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【答案】應(yīng)助回帖
★
shuifen1108: 金幣+1, 謝謝 2013-03-04 13:51:41
shuifen1108: 金幣+1, 謝謝 2013-03-04 13:51:41
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1. 我們實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)過T載體污染的現(xiàn)象。連到pET載體上之后轉(zhuǎn)化，然后長出的克隆提質(zhì)粒酶切發(fā)現(xiàn)大小不對，最后發(fā)現(xiàn)都是T載體。 2. 假陽性，所以要注意連接體系中insert和vertor的比例問題，還有就是把vector進(jìn)行一下堿性磷酸酶處理，減少假陽性。 3. 所謂的鑒定不出來是什么意思？酶切切不開還是根本就提不出質(zhì)粒？還是質(zhì)粒自連？如果是能提出質(zhì)粒但是切不開，有沒有可能被甲基化酶修飾了？我們以前也碰到這種情況的。用一個酶就是切不開，后來發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中質(zhì)粒擴(kuò)增時，那個位點(diǎn)被甲基化了。 |
7樓2013-03-01 17:17:02
2樓2011-11-23 13:18:16
shuifen1108
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3樓2011-11-23 14:39:17
jingdejun
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【答案】應(yīng)助回帖
★
linyingjia(金幣+1): 有道理 2011-11-23 19:55:57
shuifen1108(金幣+2): 2011-11-24 21:18:01
linyingjia(金幣+1): 有道理 2011-11-23 19:55:57
shuifen1108(金幣+2): 2011-11-24 21:18:01
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提供一個思考的方向，能在AMP板子上長出來的也不一定是陽性的。 不信的話，你就挑這些菌落液體培養(yǎng)（加AMP抗性），有些菌就不會長。 之所以會在板子上長出來，最大的可能性就是培養(yǎng)時間過長導(dǎo)致的。 做完轉(zhuǎn)化的板子放在4度冰箱，原本的小菌落會變大，原本沒有菌落的地方也可能會長出來一些單菌落，就是差不多的原因。 最好的話就是重新做吧。有時候不要問那么多的原因，重做說不定就會一次成功，特別是做分子的。  希望對樓主有所幫助。最后祝實(shí)驗(yàn)順利。  |
4樓2011-11-23 16:39:28
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