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5xiaosh銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
DNA 條帶 和 OD值
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繼前面RNA條帶和OD值哪個(gè)更重要的帖子，我也提一下自己最近實(shí)驗(yàn)遇到的問題，請(qǐng)大俠們看看。我是第一次做，遇到這樣的問題，不知該怎么解釋？ 最近從新生裸鼠組織里提 rna（用的試劑盒） 測(cè)濃度60ng/ul 測(cè)OD值A(chǔ)260/A280=2.0 我沒有跑膠看 分裝后凍到-80的冰箱里去了 過(guò)了不到1周 我今天取了一管 測(cè)濃度50ng/ul A260/A280=2.15 然后 我用試劑盒（takara）做逆轉(zhuǎn)錄 擴(kuò)cdna 反應(yīng)后測(cè)濃度869ng/ul，OD值A(chǔ)260/A280=2.06， 然后用該cdna模板做pcr（10ul反應(yīng)體系，cDNA稀釋了10倍，加了2ul），設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，做了4管， 同樣反應(yīng)結(jié)束后測(cè)DNA濃度 500ng/ul OD值A(chǔ)60/A280=1.8多 可是跑膠 （我加了7ul 擴(kuò)增樣品，2.5ulbuffer） 卻什么都沒跑出來(lái) 很干凈 。為什么測(cè)濃度，測(cè)OD值都有，卻沒有條帶呢 ？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
5xiaosh: 回帖置頂 2011-12-20 14:32:56
5xiaosh(金幣+2): 我在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前測(cè)了一下ep管里的反應(yīng)液OD，500多ng/ul。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)是cDNA沒有擴(kuò)出來(lái)，因?yàn)槲覜]加Rnasin。O(∩_∩)~ 2011-12-20 14:35:59
5xiaosh(金幣+2): 我在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前測(cè)了一下ep管里的反應(yīng)液OD，500多ng/ul。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)是cDNA沒有擴(kuò)出來(lái)，因?yàn)槲覜]加Rnasin。O(∩_∩)~ 2011-12-20 14:35:59
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你擴(kuò)完的cDNA怎么能測(cè)濃度呢？如果你是直接測(cè)濃度里面一大堆亂七八糟的東西，測(cè)出來(lái)的濃度完全沒有可信度。 你做PCR的時(shí)候加一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（actin什么的），你只用你自己設(shè)計(jì)的四個(gè)引物做很難說(shuō)明問題，可能本來(lái)PCR體系或引物就有問題。 |
9樓2011-12-19 10:26:40
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2樓2011-12-18 00:28:15
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3樓2011-12-18 12:19:41
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4樓2011-12-18 13:40:39
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5樓2011-12-18 13:53:44
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6樓2011-12-18 14:20:20
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7樓2011-12-18 14:51:44
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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我們實(shí)驗(yàn)室沒有那么嚴(yán)格，直接倒下水道了。不過(guò)我們是后染色，所以電泳槽里EB污染不多。 據(jù)說(shuō)放在大陽(yáng)底下曬曬也可以降解EB，樓主可以放在太陽(yáng)下暴曬幾天再倒。 其實(shí)最好就是用個(gè)電泳槽獨(dú)立出來(lái)專門跑RNA用。 配膠及電泳液都用新配的電泳液。loading最好也用一管新的。 一般配1-1.5%的膠，7-9V/cm電泳15-20min（溴芬蘭出孔約2cm），多跑幾次總結(jié)總結(jié)經(jīng)驗(yàn)就可以了。可以點(diǎn)個(gè)DL2000的DNA Marker。 |
8樓2011-12-19 10:22:38
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10樓2011-12-19 11:37:38
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