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菌落PCR無(wú)條帶
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| 雙酶切T載體和表達(dá)載體后，回收獲得目的片段和載體，連接，轉(zhuǎn)化，挑18個(gè)單克隆，菌落PCR全部無(wú)條帶，這是怎么回事，目的片段確定酶切成功，表達(dá)載體無(wú)法從電泳圖上確定是否兩個(gè)位點(diǎn)都酶切成功（兩個(gè)酶切位點(diǎn)緊連著）�？赡苁鞘裁丛蚰兀� |
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panda73
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西瓜(金幣+3): Good！ 2011-12-22 18:35:56
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| 載體的處理很重要，你如果不確定載體是否處理完全，可以在做雙酶切時(shí)，設(shè)置類似的單酶切對(duì)照，根據(jù)質(zhì)粒帶型的變化確定是否在雙酶切體系中，兩個(gè)酶都正常工作了。另外，雙酶切時(shí)，加的酶量很重要，多了容易star activity，而加少了，容易導(dǎo)致酶切不完全，連接時(shí)出現(xiàn)大量的載體自連，克隆效率很低。根據(jù)酶單位的定義，可以大致推算出酶切一定量的質(zhì)粒DNA應(yīng)該加多少酶量。有些專門計(jì)算雙酶切是酶用量的軟件。 |
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筆冰河9樓2011-12-20 21:41:26
xhy0016
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
筆冰河(金幣+1): 去磷酸化的條件是什么呢，要自己配溶液?jiǎn)幔�是有試劑盒買 2011-12-20 14:40:34
西瓜(金幣+3): Good 2011-12-22 18:34:35
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西瓜(金幣+3): Good 2011-12-22 18:34:35
| 有這么多假陽(yáng)性？一般我連接載體，陽(yáng)性率高于90%。只有當(dāng)PCR直接酶切時(shí)候，有部份結(jié)果連接錯(cuò)誤。所以我覺(jué)的還是酶切不完全吧。菌液PCR有做對(duì)照嗎？如果是陽(yáng)性一般都有條帶。樓主如果不想更改酶切體系，可以試試去磷酸化。 |
4樓2011-12-20 09:03:18
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8樓2011-12-20 20:27:41
10樓2011-12-21 19:38:38
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