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[求助]
菌落PCR無條帶
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| 雙酶切T載體和表達(dá)載體后，回收獲得目的片段和載體，連接，轉(zhuǎn)化，挑18個(gè)單克隆，菌落PCR全部無條帶，這是怎么回事，目的片段確定酶切成功，表達(dá)載體無法從電泳圖上確定是否兩個(gè)位點(diǎn)都酶切成功（兩個(gè)酶切位點(diǎn)緊連著）�？赡苁鞘裁丛蚰�？ |
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panda73
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西瓜(金幣+3): Good！ 2011-12-22 18:35:56
西瓜(金幣+3): Good！ 2011-12-22 18:35:56
| 載體的處理很重要，你如果不確定載體是否處理完全，可以在做雙酶切時(shí)，設(shè)置類似的單酶切對照，根據(jù)質(zhì)粒帶型的變化確定是否在雙酶切體系中，兩個(gè)酶都正常工作了。另外，雙酶切時(shí)，加的酶量很重要，多了容易star activity，而加少了，容易導(dǎo)致酶切不完全，連接時(shí)出現(xiàn)大量的載體自連，克隆效率很低。根據(jù)酶單位的定義，可以大致推算出酶切一定量的質(zhì)粒DNA應(yīng)該加多少酶量。有些專門計(jì)算雙酶切是酶用量的軟件。 |
筆冰河9樓2011-12-20 21:41:26
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4樓2011-12-20 09:03:18
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