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[求助]
[重金求助] 細(xì)菌鑒定的若干入門(mén)級(jí)問(wèn)題請(qǐng)教(16S rDNA)
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從前一直搞環(huán)境工程，后來(lái)篩選到了甲烷氧化菌一株，但經(jīng)過(guò)了一系列的鑒定工作，發(fā)現(xiàn)了很多問(wèn)題，大致過(guò)程如下： （1）最開(kāi)始是把多次傳代（甲烷為唯一碳源）的固體平板寄給了大連寶生物公司，通過(guò)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序未發(fā)現(xiàn)套峰，但測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)并不屬于甲烷氧化菌，而是另一種屬（暫時(shí)命名為菌X）； （2）本以為菌X是一種新的可氧化甲烷的細(xì)菌，但相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜叶颊J(rèn)為菌株不純，所以自己也開(kāi)始懷疑是否體系有雜菌。 （3）最近在國(guó)外訪學(xué)，開(kāi)始嘗試自己提取16S，選用了廣普微生物擴(kuò)增引物（F27和R14），首先用一種高保真的酶沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)，之后換了另一種（易擴(kuò)增但個(gè)別堿基可能突變）成功，擴(kuò)增后測(cè)序。無(wú)奈的是美國(guó)這邊服務(wù)很有限，只告知了2個(gè)測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果，并未給出最終的16S rDNA序列。 請(qǐng)各位熟悉相關(guān)實(shí)驗(yàn)的蟲(chóng)友協(xié)助分析并解答一下問(wèn)題： （1）是否存在這種可能：雖然平板上菌株主要為甲烷氧化菌，但廣普引物無(wú)法擴(kuò)增出甲烷氧化菌，卻擴(kuò)增出來(lái)了與之共存的另一種雜菌。 也就是說(shuō)，采用以上引物，對(duì)2個(gè)或者以上的細(xì)菌混合物進(jìn)行PCR，可能只擴(kuò)增出一種。 （2）如何根據(jù)測(cè)序反應(yīng)的結(jié)果，將兩個(gè)反應(yīng)結(jié)果合并為一個(gè)完整的16S rDNA序列。 多謝�。�！ |
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9樓2012-01-19 10:35:48
11樓2012-01-20 11:59:13
catty2000
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2樓2012-01-17 11:07:36
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
rainwander(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-17 18:56:31
zhaott(金幣+49): ★有幫助 謝謝 2012-01-19 10:40:28
zhang8826857(金幣-49): lz給了一個(gè)金幣，給我說(shuō)好像是加錯(cuò)了，呵呵，不好意思啊 2012-01-20 19:05:32
zhang8826857(金幣+5): 唉，我真二，呵呵，給你扣光了，當(dāng)補(bǔ)償下吧 2012-01-20 19:06:44
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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| 可直接用DNAMAN等軟件將2個(gè)反應(yīng)的結(jié)果比對(duì)一下，按重復(fù)部分的進(jìn)行拼接就可以得到完整的一條序列了 |
3樓2012-01-17 11:10:38
4樓2012-01-17 13:06:52
longage.gene
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6樓2012-01-17 17:32:59
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhang8826857(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-18 11:47:29
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zhang8826857(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-18 11:47:29
| 首先就如1樓所說(shuō)的，繼續(xù)純化，挑取單克隆進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增（可以多挑幾個(gè)，也可以換幾對(duì)擴(kuò)增引物），然后送測(cè)序，把得到的序列用chromose處理（去掉前面的30-40個(gè)堿基和大約800bp之后的序列），得到兩個(gè)反應(yīng)序列用DNAman拼接（DNAman中有一個(gè)sequence assemble，導(dǎo)入你得到的兩個(gè)處理過(guò)的序列就可以），就能得到16S rDNA的全長(zhǎng)，放在NCBI里面blastn一下就知道是哪個(gè)菌了。 |
7樓2012-01-18 08:05:34
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8樓2012-01-18 22:23:12
girlfisher
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zhang8826857(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-20 19:10:29
zhang8826857(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-20 19:10:29
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1. 如果樓主可以通過(guò)采用某些甲烷氧化基因的通用引物PCR+測(cè)序來(lái)確定是否存在甲烷氧化菌，前提是有這種引物。 2.你確定你的甲烷氧化菌是細(xì)菌不是古菌？ 3.對(duì)于混合菌群，在提取DNA過(guò)程中可能存在bias，某些細(xì)菌由于提取方法的無(wú)效而產(chǎn)率很低。 4. 如果共存多種細(xì)菌而甲烷菌以優(yōu)勢(shì)存在，可以做克隆文庫(kù)，多測(cè)一些克隆子來(lái)獲得甲烷氧化細(xì)菌的16S序列。 |
10樓2012-01-20 10:10:34
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