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[重金求助] 細(xì)菌鑒定的若干入門級(jí)問題請(qǐng)教(16S rDNA)
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從前一直搞環(huán)境工程，后來篩選到了甲烷氧化菌一株，但經(jīng)過了一系列的鑒定工作，發(fā)現(xiàn)了很多問題，大致過程如下： （1）最開始是把多次傳代（甲烷為唯一碳源）的固體平板寄給了大連寶生物公司，通過PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序未發(fā)現(xiàn)套峰，但測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)并不屬于甲烷氧化菌，而是另一種屬（暫時(shí)命名為菌X）； （2）本以為菌X是一種新的可氧化甲烷的細(xì)菌，但相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜叶颊J(rèn)為菌株不純，所以自己也開始懷疑是否體系有雜菌。 （3）最近在國外訪學(xué)，開始嘗試自己提取16S，選用了廣普微生物擴(kuò)增引物（F27和R14），首先用一種高保真的酶沒有擴(kuò)增出來，之后換了另一種（易擴(kuò)增但個(gè)別堿基可能突變）成功，擴(kuò)增后測序。無奈的是美國這邊服務(wù)很有限，只告知了2個(gè)測序反應(yīng)的結(jié)果，并未給出最終的16S rDNA序列。 請(qǐng)各位熟悉相關(guān)實(shí)驗(yàn)的蟲友協(xié)助分析并解答一下問題： （1）是否存在這種可能：雖然平板上菌株主要為甲烷氧化菌，但廣普引物無法擴(kuò)增出甲烷氧化菌，卻擴(kuò)增出來了與之共存的另一種雜菌。 也就是說，采用以上引物，對(duì)2個(gè)或者以上的細(xì)菌混合物進(jìn)行PCR，可能只擴(kuò)增出一種。 （2）如何根據(jù)測序反應(yīng)的結(jié)果，將兩個(gè)反應(yīng)結(jié)果合并為一個(gè)完整的16S rDNA序列。 多謝！��！ |
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2樓2012-01-17 11:07:36
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
rainwander(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-17 18:56:31
zhaott(金幣+49): ★有幫助 謝謝 2012-01-19 10:40:28
zhang8826857(金幣-49): lz給了一個(gè)金幣，給我說好像是加錯(cuò)了，呵呵，不好意思啊 2012-01-20 19:05:32
zhang8826857(金幣+5): 唉，我真二，呵呵，給你扣光了，當(dāng)補(bǔ)償下吧 2012-01-20 19:06:44
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zhang8826857(金幣+5): 唉，我真二，呵呵，給你扣光了，當(dāng)補(bǔ)償下吧 2012-01-20 19:06:44
| 可直接用DNAMAN等軟件將2個(gè)反應(yīng)的結(jié)果比對(duì)一下，按重復(fù)部分的進(jìn)行拼接就可以得到完整的一條序列了 |
3樓2012-01-17 11:10:38
4樓2012-01-17 13:06:52
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhang8826857(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-18 11:47:29
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zhang8826857(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2012-01-18 11:47:29
| 首先就如1樓所說的，繼續(xù)純化，挑取單克隆進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增（可以多挑幾個(gè)，也可以換幾對(duì)擴(kuò)增引物），然后送測序，把得到的序列用chromose處理（去掉前面的30-40個(gè)堿基和大約800bp之后的序列），得到兩個(gè)反應(yīng)序列用DNAman拼接（DNAman中有一個(gè)sequence assemble，導(dǎo)入你得到的兩個(gè)處理過的序列就可以），就能得到16S rDNA的全長，放在NCBI里面blastn一下就知道是哪個(gè)菌了。 |
7樓2012-01-18 08:05:34
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