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[交流]
大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化子總是空載體，請(qǐng)高手指點(diǎn)
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最近做克隆測(cè)序，非常不順利，很苦惱。簡(jiǎn)單描述一下： 目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T載體，載體和PCR產(chǎn)物比例為1:4左右，4度連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，以control片段做對(duì)照，42度熱擊，復(fù)壯后涂amp板子，培養(yǎng)14小時(shí)候，平板上有菌落長(zhǎng)出來（解釋一下：為了省事，沒有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR驗(yàn)證時(shí)，陽性克隆很少很少，是怎么回事��？求各位高手指點(diǎn)一下，謝謝了 |
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2012-02-22 13:43:29
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)交流 2012-02-22 13:43:29
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如果很急 可以買點(diǎn)感受態(tài)來試試 我曾經(jīng)遇到過這個(gè)問題，也可以找點(diǎn)別人成功的質(zhì)粒來驗(yàn)證你的感受態(tài)效率。 如果經(jīng)費(fèi)允許，可以用 Takara 的感受態(tài)，效果還不錯(cuò) 一只（100ul）可以做5個(gè)樣。 我一直這么做的。 還有注意 你培養(yǎng)箱的溫度。我出現(xiàn)過，顯示37度，實(shí)測(cè)42度，當(dāng)然長(zhǎng)不出。 |
33樓2012-02-22 13:34:38
14樓2012-02-19 19:50:49
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mirror3895(金幣+1):謝謝參與
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)積極交流哦 2012-02-20 13:37:21
mirror3895(金幣+1):謝謝參與
小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)積極交流哦 2012-02-20 13:37:21
| 16度和4度連接，我們都試過，對(duì)于連T載體來說，都差不多，T載體應(yīng)該很好連的。你對(duì)照長(zhǎng)的菌斑多不多，如果不多，可能就是轉(zhuǎn)化效率不高，需要重新制感受態(tài)細(xì)胞。如果是你的連接產(chǎn)物長(zhǎng)的不多，那可能就是你的目的基因有問題了，一般來說，連T載體會(huì)長(zhǎng)很多菌斑。載體+基因＝1+4或0.5+4.5。這是我們平常用的，都沒有什么區(qū)別，連T載體，我感覺加不加IPTG/Xgal都行，因?yàn)檫B接效率很高，基本上都是陽性的。 |
17樓2012-02-20 10:24:03
19樓2012-02-20 16:41:56
20樓2012-02-20 16:50:59
22樓2012-02-20 18:54:56
32樓2012-02-22 12:21:09
liujianmin68
木蟲 (職業(yè)作家)
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西瓜(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-22 18:42:06
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首先，進(jìn)行T-A連接，4度或16度均可，不過TAKARA的試劑盒里說明用16度，因此，用這個(gè)載體最好還是16度連接比較好。Promega公司的T載體4度連接效率還是很高的。 第二，載體和片段之間有一定的比例是應(yīng)該的，x-gal和IPTG可以不加，你選擇1：4不是太大問題，其實(shí)用1：2即可。 之所以出現(xiàn)你現(xiàn)在這種情況，你要確認(rèn)：1、你的pcr產(chǎn)物是不是用高保真酶擴(kuò)增的？2、你的引物是不是跟載體上某些序列能非特異性結(jié)合？3、轉(zhuǎn)化子可以抽提質(zhì)粒，酶切后電泳驗(yàn)證。 |
34樓2012-02-22 15:29:22
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
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酒精沉淀：產(chǎn)物（一般為100ul，不足的話加水補(bǔ)充）+1/10體積醋酸鈉（3M，PH＝5.2）+2.5體積100%酒精。－80度沉淀30分鐘，（－20度也行，時(shí)間稍長(zhǎng)些）；12000rpm,10min;去上清，75% Eth,12000,10min；去上清，100%Eth,去上清，晾干即可。 酒精最好都是預(yù)冷的 |
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mirror389540樓2012-02-25 11:05:55
Petter_JDW
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lxj341401
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userhung
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zhang8826857
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mirror3895(金幣+1):謝謝參與
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| PCR產(chǎn)物一定要是用還有A尾的Taq酶，并要用純化試劑盒純化！如果沒有PCR片段沒有A，那么可以通過一步加A的步驟，然后再連接 |
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21樓2012-02-20 17:40:34
23樓2012-02-20 20:09:44
24樓2012-02-20 22:48:02
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
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你用什么酶做的PCR？ 最好用普通的Taq酶啊！希望實(shí)驗(yàn)成功 |
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25樓2012-02-21 08:35:23
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30樓2012-02-22 08:57:01
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
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如果PCR量很低，可以用1+4的比例，我試過這樣的體系，沒有問題的。不過一般0.5+4.5就行了。只要PCR產(chǎn)物不是平末端，連T載體應(yīng)該是很好連的，PCR擴(kuò)增后，最好把產(chǎn)物純化下，酒精沉淀或膠回收都可以。 |
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31樓2012-02-22 09:00:01
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簡(jiǎn)單回復(fù)
sxp10316樓
2012-02-19 15:29
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mirror3895(金幣+1):謝謝參與
祝福祝福
江南的竹7樓
2012-02-19 15:37
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mirror3895(金幣+1):謝謝參與
2012-02-19 15:46
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mirror3895(金幣+1):謝謝參與
kanghuijun10樓
2012-02-19 15:47
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mirror3895(金幣+1):謝謝參與
echo123418樓
2012-02-20 15:43
回復(fù)
mirror3895(金幣+1):謝謝參與
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