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[求助]
新人關(guān)于引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題
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本人做定點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)一對(duì)包含突變位點(diǎn)的引物 其中反義鏈引物（即退火時(shí)與正義鏈結(jié)合的引物，不知道是不是這樣稱呼，新手啊  ）為：5’-CCAGGTCGGACCCCCGAGGGACTCTG-3‘試圖通過(guò)overlap pcr將突變引物原基因中，然而在第一輪pcr中，電泳條帶位置與預(yù)期的不符，因此懷疑引物錯(cuò)配，通過(guò)使用NCBI的blast，將引物與模板進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖所示 可以發(fā)現(xiàn)，除了第一對(duì)是模板與引物的同源序列（即所求突變位點(diǎn)所在的相應(yīng)位點(diǎn)）外，其他有好幾對(duì)是引物中友6,7個(gè)堿基與模板其他位置的錯(cuò)配。而且這些錯(cuò)配的堿基在突變位點(diǎn)的兩端都存在，甚至包括突變位點(diǎn)！ 在pcr過(guò)程中，采用 Touch Down PCR，可是還是出現(xiàn)錯(cuò)誤的條帶 各位高人，這可如何處理啊 [ Last edited by 麻花13 on 2012-2-21 at 18:30 ] |
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