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顏小泡泡新蟲 (初入文壇)
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[求助]
引物設(shè)計(jì)——下游引物是否需要考慮閱讀框問題
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如題，本人是分子生物學(xué)小菜鳥一枚，最近剛學(xué)習(xí)如何設(shè)計(jì)引物，非常困惑。。。 請問大家，在設(shè)計(jì)上游引物的時(shí)候，起始密碼子ATG的閱讀框是要格外注意的，不能在加完酶切位點(diǎn)之后把閱讀框破壞掉 那么下游引物是否需要考慮閱讀框的問題呢？如果加完下游酶切位點(diǎn)，閱讀框被破壞了，是否也需要補(bǔ)加堿基 還有，補(bǔ)加的堿基會(huì)不會(huì)影響目的基因所合成的蛋白質(zhì)的表達(dá)呢。。 最后一個(gè)問題，下游引物是否需要考慮加入終止密碼子呢，謝謝各位了！ |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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amisking: 金幣+2, 感謝發(fā)帖應(yīng)助，幫助蟲子 2013-11-10 18:43:00
amisking: 金幣+2, 感謝發(fā)帖應(yīng)助，幫助蟲子 2013-11-10 18:43:00
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首先根據(jù)你最后一個(gè)問題，說明你還沒有明白PCR的機(jī)制，或者說是沒有用自己的理解來消化。引物的設(shè)計(jì)不需要啟動(dòng)子和終止子，PCR產(chǎn)物的長短大小，完全取決于你設(shè)計(jì)的引物與目的DNA的同源型結(jié)合位點(diǎn)。 再來，你說上游別破壞了閱讀框，那么下游也就不會(huì)破壞了，上下游引物是互補(bǔ)的兩條鏈的引物，，，說的有點(diǎn)復(fù)雜，有問題可以線上繼續(xù)討論。 |
2樓2013-11-10 18:17:30
顏小泡泡
新蟲 (初入文壇)
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3樓2013-11-10 19:41:48
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-10 22:59:41
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-10 22:59:41
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說句實(shí)話，PCR引物的設(shè)計(jì)問題很微妙。如果按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出一個(gè)紙面上完美無暇的，在實(shí)際應(yīng)用中往往就不一定好用，反之亦然。這對新手來說很頭痛，很多情況下是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定。你的擴(kuò)一整個(gè)基因？是說一個(gè)完整酶或者蛋白的編碼基因吧？這個(gè)你只要找到同源序列，對這個(gè)同源序列下功夫就行。我也是剛剛走出對引物設(shè)計(jì)的迷茫，有的還不是很透徹，只能給你一點(diǎn)建議：大膽細(xì)心的設(shè)計(jì)，不要怕錯(cuò)，多試。 |
4樓2013-11-10 21:30:20
凌波麗
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顏小泡泡: 金幣+1, ★有幫助 2013-11-13 19:46:18
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顏小泡泡: 金幣+1, ★有幫助 2013-11-13 19:46:18
| 如果你的基因片段是完整的基因片段就不會(huì)有啟動(dòng)子和終止子不用再加。如果是ORF，那么就要就要加上終止子。PCR擴(kuò)增出來的啟動(dòng)子之前的片段如果沒有構(gòu)成明顯的破壞原來的SD sequence（比如與SD sequence明顯的堿基配對二級結(jié)構(gòu)的引物序列），或者構(gòu)成的全新的SD sequence緊隨其后會(huì)有新的位點(diǎn)適當(dāng)?shù)谹TG位點(diǎn)出現(xiàn)，那么在原核細(xì)胞中表達(dá)應(yīng)該沒有問題，一般不會(huì)引起閱讀框的改變。如果是在真核細(xì)胞中表達(dá)，則引物不要破壞原來的5'-UTR sequence和3'-UTR sequence就一般不會(huì)引起閱讀框的改變。 |
5樓2013-11-10 22:53:14
凌波麗
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6樓2013-11-10 22:55:43
cicelyzh
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你擴(kuò)增整個(gè)基因的目的是什么？如果是表達(dá)的話，要看是用native的啟動(dòng)子，還是用特定的啟動(dòng)子。如果用現(xiàn)有的表達(dá)載體做過表達(dá)的話，啟動(dòng)子終止子的序列都在表達(dá)載體上了，你不需要考慮的。如果你要用基因本身的啟動(dòng)子表達(dá)，做克隆的時(shí)候當(dāng)然要包括啟動(dòng)子序列。如果你想用其它啟動(dòng)子表達(dá)，則需要單獨(dú)克隆。 做基因表達(dá)時(shí)，設(shè)計(jì)下游引物是否帶終止密碼子要看你是否克隆到C端帶標(biāo)簽的表達(dá)載體上。如果C端有標(biāo)簽融合，就需要設(shè)計(jì)引物到終止密碼子前。如果C端不帶tag，引物中要有終止密碼子。 |
7樓2013-11-11 02:20:32
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