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顏小泡泡新蟲 (初入文壇)
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[求助]
引物設(shè)計(jì)——下游引物是否需要考慮閱讀框問題
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如題，本人是分子生物學(xué)小菜鳥一枚，最近剛學(xué)習(xí)如何設(shè)計(jì)引物，非常困惑。。。 請問大家，在設(shè)計(jì)上游引物的時(shí)候，起始密碼子ATG的閱讀框是要格外注意的，不能在加完酶切位點(diǎn)之后把閱讀框破壞掉 那么下游引物是否需要考慮閱讀框的問題呢？如果加完下游酶切位點(diǎn)，閱讀框被破壞了，是否也需要補(bǔ)加堿基 還有，補(bǔ)加的堿基會不會影響目的基因所合成的蛋白質(zhì)的表達(dá)呢。。 最后一個(gè)問題，下游引物是否需要考慮加入終止密碼子呢，謝謝各位了！ |
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 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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顏小泡泡
新蟲 (初入文壇)
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3樓2013-11-10 19:41:48
★ ★
amisking: 金幣+2, 感謝發(fā)帖應(yīng)助，幫助蟲子 2013-11-10 18:43:00
amisking: 金幣+2, 感謝發(fā)帖應(yīng)助，幫助蟲子 2013-11-10 18:43:00
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首先根據(jù)你最后一個(gè)問題，說明你還沒有明白PCR的機(jī)制，或者說是沒有用自己的理解來消化。引物的設(shè)計(jì)不需要啟動子和終止子，PCR產(chǎn)物的長短大小，完全取決于你設(shè)計(jì)的引物與目的DNA的同源型結(jié)合位點(diǎn)。 再來，你說上游別破壞了閱讀框，那么下游也就不會破壞了，上下游引物是互補(bǔ)的兩條鏈的引物，，，說的有點(diǎn)復(fù)雜，有問題可以線上繼續(xù)討論。 |
2樓2013-11-10 18:17:30
★ ★
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-10 22:59:41
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-11-10 22:59:41
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說句實(shí)話，PCR引物的設(shè)計(jì)問題很微妙。如果按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出一個(gè)紙面上完美無暇的，在實(shí)際應(yīng)用中往往就不一定好用，反之亦然。這對新手來說很頭痛，很多情況下是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定。你的擴(kuò)一整個(gè)基因？是說一個(gè)完整酶或者蛋白的編碼基因吧？這個(gè)你只要找到同源序列，對這個(gè)同源序列下功夫就行。我也是剛剛走出對引物設(shè)計(jì)的迷茫，有的還不是很透徹，只能給你一點(diǎn)建議：大膽細(xì)心的設(shè)計(jì)，不要怕錯(cuò)，多試。 |
4樓2013-11-10 21:30:20
凌波麗
專家顧問 (知名作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
顏小泡泡: 金幣+1, ★有幫助 2013-11-13 19:46:18
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
顏小泡泡: 金幣+1, ★有幫助 2013-11-13 19:46:18
| 如果你的基因片段是完整的基因片段就不會有啟動子和終止子不用再加。如果是ORF，那么就要就要加上終止子。PCR擴(kuò)增出來的啟動子之前的片段如果沒有構(gòu)成明顯的破壞原來的SD sequence（比如與SD sequence明顯的堿基配對二級結(jié)構(gòu)的引物序列），或者構(gòu)成的全新的SD sequence緊隨其后會有新的位點(diǎn)適當(dāng)?shù)谹TG位點(diǎn)出現(xiàn)，那么在原核細(xì)胞中表達(dá)應(yīng)該沒有問題，一般不會引起閱讀框的改變。如果是在真核細(xì)胞中表達(dá)，則引物不要破壞原來的5'-UTR sequence和3'-UTR sequence就一般不會引起閱讀框的改變。 |
5樓2013-11-10 22:53:14
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