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thestormcong銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
red基因敲除轉(zhuǎn)化子
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| 小弟最近做了一輪電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也還可以，20個(gè)左右，可是暫時(shí)挑取的轉(zhuǎn)化子都是假陽(yáng)性，pcr條帶的大小跟野生株的一樣，目的基因沒有被置換。懷疑是不是轉(zhuǎn)化的時(shí)候模板沒有去除干凈的原因。我用dpnI消化，再切膠回收。50ulpcr產(chǎn)物加1ul的酶和3ul的T buffer。請(qǐng)教各位有經(jīng)驗(yàn)的蟲子給點(diǎn)建議。還有在這些轉(zhuǎn)化子里面，如果我接著挑，有沒有可能挑到我想要的呢？ |
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zhaohq1209
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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thestormcong: 金幣+8 2012-04-06 22:29:57
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| red同源重組的缺失方法中，帶抗性的目的片段應(yīng)該是從質(zhì)粒上PCR得來的吧？最好能在PCR之前將質(zhì)粒酶切線性化，而且將第一輪PCR的產(chǎn)物回收作為模板進(jìn)行第二輪PCR，回收第二輪的產(chǎn)物電轉(zhuǎn)進(jìn)入待缺失的細(xì)菌，這樣可以有效避免假陽(yáng)性的出現(xiàn) |
2樓2012-03-29 22:42:05
thestormcong
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3樓2012-03-29 22:53:01
thestormcong
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4樓2012-04-06 22:32:03
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