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[求助]
關(guān)于載體的問題
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小弟最近遇到點問題，很是頭疼，請教大家一下。 上個月的時候，我構(gòu)建了一個蛋白的FLAG融合表達載體，測序沒有問題。轉(zhuǎn)染以后，定量和半定量，都有結(jié)果，上調(diào)500倍左右。當時沒做WESTERN直接做的IP，結(jié)果驗證不到FLAG的表達。一直沒解決。 這幾天又構(gòu)建了同一個蛋白的EGFP的載體，測序沒問題�？墒寝D(zhuǎn)染以后，完全看不到綠色熒光。 請問到底是什么原因？這個蛋白在細胞中本身也有表達。 |
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超然渡陳
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- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, Good!果斷優(yōu)秀~ 2012-04-03 15:07:45
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一，你構(gòu)建載體所用的是成熟肽還是帶有信號肽的全長肽？假如是分泌蛋白的話必須去掉信號肽才能做功能和定位研究。不然你的目的蛋白都大量分泌到胞外了，胞內(nèi)殘留的那一點用一般方法檢查很困難。 二，是不是你的目的蛋白過大？在與Flag或者GFP融合表達的時候會吧這兩個蛋白包被在中間？ 三，構(gòu)建載體的時候目的蛋白和Flag或者GFP直接要加一個linker，二者直接連接的話會影響彼此的空間構(gòu)象。 |
2樓2012-04-03 10:46:26
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