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龍開(kāi)聰金蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
十萬(wàn)火急，重組質(zhì)粒酶切只有一條帶，測(cè)序有結(jié)果，但反復(fù)說(shuō)我質(zhì)粒濃度很低
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 我使用的載體是Pet-32a（+），宿主菌是BL21(DE3)，連接上目的基因后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，30微升體系，酶切能看到兩個(gè)條帶，但目的基因被切下的條帶很淡很淡，送出去測(cè)序，結(jié)果正確，但發(fā)送的報(bào)告反復(fù)說(shuō)我質(zhì)粒濃度很低，我進(jìn)行表達(dá)后，確實(shí)表達(dá)量很不理想，用改目的基因連接到pcDNA3.1(+)上后，轉(zhuǎn)化JM109，重新提取質(zhì)粒，酶切使用了30微升體系，只看到載體的條帶，使用了60微升體系后，目的基因的條帶任然非常淡，近乎看不見(jiàn)，送重組菌出去測(cè)序，正反兩個(gè)方向測(cè)序，卻只有正一個(gè)方向有結(jié)果，表明我目的基因是連接上去了，但另一個(gè)方向測(cè)序卻無(wú)結(jié)果，報(bào)告說(shuō)質(zhì)粒濃度太低，目的基因片段1100，測(cè)序公司為北京諾賽。求高手指點(diǎn)迷津，為何我質(zhì)粒濃度這么低，導(dǎo)致酶切看不見(jiàn)雙條帶，原核表達(dá)量極低？ |
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4樓2012-04-10 08:57:18
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3樓2012-04-10 08:55:36
srlee
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
龍開(kāi)聰: 金幣+7, 謝謝，這兩天做實(shí)驗(yàn)去了，都沒(méi)空登陸論壇，建議不錯(cuò)，受益不淺 2012-04-12 17:03:32
小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
龍開(kāi)聰: 金幣+7, 謝謝，這兩天做實(shí)驗(yàn)去了，都沒(méi)空登陸論壇，建議不錯(cuò)，受益不淺 2012-04-12 17:03:32
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看來(lái)LZ很糾結(jié)這個(gè)質(zhì)粒濃度低，呵呵！ 1）從你表述的來(lái)看，片段是連上了pET32了，測(cè)序結(jié)果也是正確的，酶切條帶的亮弱直接與你提取的質(zhì)粒濃度有關(guān)系，好像與酶切體系沒(méi)多大關(guān)系。 2）試驗(yàn)中我也感覺(jué)pET系列載體copy數(shù)確實(shí)不太高，好像是中等拷貝吧，只好加大提取質(zhì)粒的菌量了，從而提高質(zhì)粒的濃度。 3）另外你用的BL21(DE3)是表達(dá)蛋白的宿主菌，如果你換用克隆表達(dá)宿主菌XL-1 blue或DH5a來(lái)提取質(zhì)粒也許量就會(huì)多一些了。 祝實(shí)驗(yàn)順利！ [ Last edited by srlee on 2012-4-11 at 12:49 ] |
5樓2012-04-10 22:17:34
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