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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 蛋白突變后不表達了
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laverne銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
蛋白突變后不表達了 已有4人參與
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大家好，我現(xiàn)在實驗遇到個現(xiàn)象，苦惱ing，煩請大家給予指點 定點突變蛋白之后，在bl21中不表達了，嘗試各種優(yōu)化，沒有效果，有人能解釋這是什么原因嗎？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 應助指數(shù)+1, 果然專業(yè)！ 2012-04-23 18:50:33
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西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 應助指數(shù)+1, 果然專業(yè)！ 2012-04-23 18:50:33
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一般來講，先確定新的啟動子存在且有效，其次確定起始轉錄位點存在且有效，然后有軟件模擬一下mRNA突變后是否構成了二級結構，是否有移碼突變，是否構成了稀有密碼子，是否提前中斷翻譯，再有考慮突變產物蛋白質是否構成新的酶切位點和是否在三維結構上發(fā)生了折疊異常（引入突變位點也是研究蛋白質折疊的一種常規(guī)實驗技術）。 還要考慮突變產物蛋白質是不是參與形成了原來沒有的超分子結構（聚合體）或者影響了原有的四級結構的形成。 |
4樓2012-04-20 17:13:50
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3樓2012-04-20 16:38:53
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5樓2012-04-23 18:48:37
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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一般來說，由于真核生物細胞中的由于存在翻譯起始因子eIF4A,eIF4B在核糖體翻譯時去除mRNA的二級結構，所以只要不是很大的二級結構改變一般不至于影響翻譯過程。你可以檢測一下工程細胞中翻譯起始因子eIF4A,eIF4B是否都正常表達，若沒有足量的eIF4A，那么mRNA的二級結構二級結構改變可能足以引起表達障礙，若沒有足量的eIF4B，那么eIF4A足量表達eIF4A的效率也會很低。 另外，我覺得你該查一下工程細胞的目的蛋白質突變后是不是影響了它與別的蛋白質或DNA特異性片段之間的專一性結合，比如說它原本與某種轉錄因子又結合，但是突變后使該結合失效。 |
6樓2012-04-23 22:10:03
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