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alicelchf木蟲 (著名寫手)
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[求助]
奇怪的PCR產(chǎn)物
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構(gòu)建的上下游引物分別攜帶了PsgI(NcoI同尾酶)、XhoI位點，得到目的片段產(chǎn)物，然后將其回收、雙酶切消化、80度滅火； 載體經(jīng)過NcoI、XhoI雙酶切，電泳切膠回收。 按照不同片段和載體比例進行連接ligase，轉(zhuǎn)化得到質(zhì)粒（6700bp左右） 問題在于（1）我們的質(zhì)粒無論是試劑盒、手提得到的濃度都很少，而且是兩條帶（附件一20120418 pet28-10）；轉(zhuǎn)化至plate有菌落，但是經(jīng)過再一次雙酶切之后電泳完全看不到任何片段或是載體。是我們根本沒連接上嗎？ （2）我們以克隆的新載體作為模板進行PCR，得到的居然更多條帶（附件二20120419 pm pcr 亞克�。�，初步覺得是因為引物特異性比較差，因為引物較長而且有些比較特殊的要求導(dǎo)致無法簡短、增加特異性；所以我都懷疑我們一直以來PCR出來的事原來模板的非目的片段。所以很想知道出現(xiàn)這么多條帶的原因有可能是什么？ 順帶說一句，我們搖出來菌渾濁了，送去檢測 nothing |
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- 附件 2 : 20120419 pcr 亞克隆.tif
2012-04-19 22:02:30, 9.76 K
2012-04-19 22:02:36, 1.25 M
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