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消錦lzhy
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[求助]
定量pcr標(biāo)曲
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| 請教各位蟲友：我之前做定量pcr（sybr green法）標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于引物二聚體比較嚴(yán)重，10的5次方拷貝數(shù)以下就不準(zhǔn)確了，現(xiàn)在考慮換一對新的引物，但是試著做了一下，也有個很嚴(yán)重的問題，就是所有的標(biāo)準(zhǔn)品Ct值幾乎一樣，我是做了梯度稀釋，從10的2次方到10的八次方，不過沒有非特異性產(chǎn)物，不知什么原因。我在想是不是需要重新做標(biāo)準(zhǔn)品呢？因為原來的標(biāo)準(zhǔn)品是用原來那個400bp左右的引物的pcr產(chǎn)物做克隆再提取質(zhì)粒得到的，現(xiàn)在想換一對200bp左右的引物，需要重新做標(biāo)準(zhǔn)品嗎嗎？（注：我用新的引物試著擴(kuò)增了一下原標(biāo)準(zhǔn)品，也有比較清晰的條帶） |
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孫啟亮
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2樓2012-04-22 09:50:34
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灰常感謝~我的引物是打算要換了，只是不知道標(biāo)準(zhǔn)品是不是也要相應(yīng)的換，我是這樣理解的：原來引物擴(kuò)增的片段（400bp）如果包含了新引物擴(kuò)增的片段（200bp）就可以不換，沒包含就需要換。我這兩條引物的position分別是：前引91–116，后引481–506（400bp）和前引211–231，后引393–416（200bp），可以看出200bp的是包含在400bp的片段中的嗎？（以前沒學(xué)過生物，對基本的原理不是很清楚），所以我就就用原來的標(biāo)準(zhǔn)品試著做了一下，是有特異性產(chǎn)物，但Ct值又無梯度，很納悶，我不知道是不是我對引物的理解有誤，還是200bp這對引物本身有問題。  |
5樓2012-04-22 15:07:43
cheng_xiao
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6樓2012-04-22 15:30:13
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7樓2012-04-22 16:35:59
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